賀滟 賈蟬憶 韓楚依 侯宏保 陳遠壽 韓勇

1遵義醫(yī)學院生理教研室（貴州遵義 563000）；2山西醫(yī)科大學藥劑學教研室（太原 030001）

20?羥二十烷四烯酸（20?hydroxyeicosatetraeno?ic acid，20?HETE）是由細胞色素P?450（CYP）酶催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）生成的重要血管活性物質［1］。最近研究發(fā)現(xiàn)20?HETE通過誘導心肌細胞凋亡作用，參與心肌缺血再灌注損傷（ischemia?reperfusion injury，IRI）進程中，加重再灌注后心肌梗死面積的發(fā)生［2］，但其中機制尚待進一步研究。Ca2+作為重要的第二信使對于維持心肌細胞正常功能起到至關重要的作用，Ca2+平衡紊亂引發(fā)的鈣超載是誘導細胞凋亡的重要因素［3-4］。在心肌細胞中，鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶（CaMKII）是調節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡的重要激酶，其激活后通過影響肌漿網(wǎng)Ryanodine（RyR2）受體通道、肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA2a）功能等作用引起細胞內Ca2+平衡紊亂，從而參與多種因素誘導的心肌細胞凋亡進程中［5-6］。然而，目前尚無20?HETE對心肌細胞內鈣離子濃度（［Ca2+］i）影響及相關作用機制的研究報道。因此，本研究主要觀察20?HETE對于培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞凋亡及細胞內鈣離子濃度的影響，并探究這其中CaMKII信號通路發(fā)揮的作用，為臨床治療相關缺血性心肌病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 20?HETE、KN?93及Fluo?3/AM鈣離子熒光探針（Sigma公司，美國），II型膠原酶（Sigma公司，美國），DMEM/F12培養(yǎng)基（HyClone公司，美國），CCK?8細胞活性檢測試劑盒（同仁公司，日本），TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物公司，中國），BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司，中國），小鼠抗SERCA2a（貨號ab205719）、小鼠抗RyR2（貨號ab205719）、兔抗CaMKIIδ（貨號ab205718）及兔抗磷酸化 CaMKIIδ（p?CaMKIIδ，貨號ab182647）（Abcam公司，美國），β?actin及HRP標記二抗（Proteintech公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國），CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）。

1.2 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 實驗采用1～3 d齡SD大鼠，購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。乳鼠開胸取出心臟，在冷PBS中將心臟剪成1 mm3碎塊，心肌組織使用0.125%胰蛋白酶和0.01%的Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化10 min，反復消化6～8次至組織完全消化。將多次消化獲得細胞懸液1 000g離心10 min，棄上清，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，37℃下5%CO2細胞培養(yǎng)箱內差速貼壁培養(yǎng)90 min，將分離純化的心肌細胞接種于細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)液中加入15%胎牛血清，青、鏈霉素（100 U/mL，0.1 mg/mL）及終濃度100 μmol/L的5?溴脫氧尿嘧啶核苷（抑制成纖維細胞生長），于5%CO2細胞培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)48 h后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用于后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組 細胞無血清培養(yǎng)12 h后，隨機分為4組，A組：對照組，培養(yǎng)液不做任何藥物處理繼續(xù)培養(yǎng)24 h；B組：20?HETE組，培養(yǎng)液中加入100 nmol/L的 20?HETE 后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；C 組：20?HETE+KN?93組，培養(yǎng)液中加入KN?93（3 μmol/L）孵育30 min后加入100 nmol/L 20?HETE培養(yǎng)24 h；D組：KN?93組（3 μmol/L），培養(yǎng)液中加入KN?93后培養(yǎng)24 h。

1.4 CCK?8法檢測細胞活性 乳鼠心肌細胞于96孔板中更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，分別加入1、3、10、50和100 nmol/L不同濃度20?HETE，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在不同時段（0、6、12、18、24 h）檢測細胞活性，分別加入10 μL CCK?8溶液孵育2 h，酶標儀450 nm波長檢測吸光度，每組設置6個復孔，重復3次，取平均值。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 乳鼠心肌細胞使用不同藥物處理后，室溫下使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS溶液沖洗3次，0.1%Triton X?100溶液處理10 min，PBS沖洗后加入50 μL TUNEL反應混合液，37℃下孵育60 mim，熒光顯微鏡下檢測結果。TUNEL陽性細胞為綠色熒光，計算每100個細胞中核陽性熒光占百分比。

1.6 Fluo?3/AM熒光探針檢測心肌細胞［Ca2+］i乳鼠心肌細胞培養(yǎng)于蓋玻片上并經(jīng)不同藥物處理后，放入含5%的Pluronic F?127及Fluo?3/AM（5 μmol/L）的DMEM/F12溶液中避光負載40 min，負載后使用新鮮DMEM/F12溶液清洗多余染料。激光共聚焦顯微鏡下掃描細胞熒光強度，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，以平均熒光強度反映細胞內［Ca2+］i，ImageJ軟件分析。

1.7 Western Blot檢測蛋白表達 乳鼠心肌細胞于使用不同藥物處理后，加入細胞裂解液，離心后取上清液BCA法檢測蛋白濃度。取等量蛋白（上樣量60 μg）進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE），轉膜后封閉1 h，分別加入一抗（小鼠抗SERCA2a、小鼠抗 RyR2、兔抗 CaMKIIδ以及兔抗p?CaMKIIδ）4℃搖床孵育過夜。一抗孵育后加入辣根過氧化物標記的二抗（抗小鼠或抗兔）室溫孵育1 h。ECL法顯影，暗室曝光，軟件分析蛋白條帶光度值，β?actin作為內參，以靶蛋白/β?actin的比值反應蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD?t方法檢驗統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 20?HETE對心肌細胞活性的影響 結果如圖1所示，1～3 nmol/L的20?HETE處理6～24 h對心肌細胞活性無顯著影響。與對照組和溶媒組相比，10、50及100 nmol/L的20?HETE處理18～ 24 h后，明顯引起心肌細胞損傷，其中100 nmol/L的20?HETE處理24 h后，細胞活性顯著下降至（58.3±4.22）%。結果表明20?HETE可以時間及濃度依賴性造成心肌細胞損傷。

2.2 KN?93對20?HETE誘導的細胞凋亡影響 前期研究發(fā)現(xiàn)20?HETE具有誘導心肌細胞凋亡作用，本研究檢測了CaMKII特異性抑制劑KN?93對20?HETE引起細胞凋亡的影響。結果如圖2所示，20?HETE處理后心肌細胞TUNEL染色陽性細胞明顯升高，由對照組的（2.31±1.32）%升至（49.8±2.3）%（P＜ 0.05），而加入KN?93后，細胞凋亡率恢復至（23.1±4.2）%（P＜0.05），表明CaMKII信號通路參與了20?HETE誘導的細胞凋亡作用。

2.3 20?HETE對［Ca2+］i影響及KN?93的作用 心肌細胞內Ca2+的穩(wěn)定對于維持細胞正常功能具有重要作用，［Ca2+］i升高引起的鈣超載是誘導心肌細胞凋亡的關鍵因素。因此，本研究應用Fluo?3/AM熒光探針法檢測了20?HETE對［Ca2+］i的影響及KN?93的作用。結果如圖3所示，與對照組相比，20?HETE組心肌細胞［Ca2+］i顯著增加了75%（P＜0.05），而加入CaMKII特異性阻斷劑KN?93后，顯著阻斷了20?HETE誘導的［Ca2+］i升高（P＜0.05）。表明20?HETE具有顯著升高［Ca2+］i的作用，誘發(fā)細胞鈣超載，而CaMKII信號通路介導了該效應。

2.4 20?HETE對RyR2、SERCA2a蛋白表達影響及KN?93的作用 蘭尼堿受體通道2（Ryanodine receptor 2，RyR2）和肌漿網(wǎng)鈣泵ATP酶（sarcoplas?mic reticulum Ca2+?ATPase2a，SERCA2a）是心肌細胞肌漿網(wǎng)膜上主要調節(jié)細胞內鈣釋放和回攝的重要蛋白，同時也是受CaMKII調節(jié)的下游靶點。因此，為探究20?HETE誘導［Ca2+］i升高的機制，我們檢測了20?HETE對RyR2和SERCA2a的蛋白水平表達的影響以及KN?93的作用。結果發(fā)現(xiàn)，20?HETE處理后的心肌細胞中，RyR2的蛋白表達量是對照組的3.3倍，而SERCA2a的蛋白表達比對照組下降32%（P＜0.05）；加入CaMKII特異性阻斷劑KN?93共同處理后，顯著抑制了20?HETE上述效應。如上結果表明，20?HETE通過影響肌漿網(wǎng)鈣通道蛋白表達改變導致細胞內Ca2+平衡紊亂，同時CaMKII信號通路參與了20?HETE這種作用。

圖1 不同濃度和處理時間條件下20?HETE對心肌細胞活性的影響Fig.1 Effects of 20?HETE on cardiomyocyte activity at different concentrations and treating duration

圖2 KN?93對20?HETE誘導的心肌細胞凋亡影響Fig.2 Effects of KN?93 on 20?HETE?induced cardiomyocyte apoptosis

2.5 20?HETE 對CaMKIIδ表達及磷酸化的影響 CaMKIIδ亞型特異性表達于心肌組織，在心肌細胞的Ca2+調控中起動態(tài)調節(jié)作用，CaMKIIδ表達升高、活性增強被認為與細胞凋亡、肥大甚至心衰密切相關。因此，本研究通過Western Blot分析了20?HETE對CaMKIIδ蛋白和磷酸化水平的影響。結果如圖5所示，與對照組相比，20?HETE顯著增加了CaMKIIδ的表達并促進其磷酸化水平升高（P＜ 0.05），KN?93阻斷了這種效應。說明20?HETE可通過激活CaMKII信號通路機制誘導心肌細胞［Ca2+］i升高及凋亡。

3 討論

20?HETE是由CYP酶家族中CYP4A和4F酶催化AA生成的重要血管活性物質，大量研究表明20?HETE在調節(jié)腎、腦、骨骼肌和腸系膜等動脈血管平滑肌肌源性收縮中發(fā)揮了重要的作用，它的合成與釋放與多種血管性疾病密切相關，如高血壓、血管內皮功能紊亂、炎性反應以及血管再生等［1，7］。近年研究發(fā)現(xiàn)CYP4A和4F酶在心肌組織中表達，在IRI進程中，CYP4A和4F表達上調、20?HETE含量增加，WEI等［8］在體大鼠IRI研究發(fā)現(xiàn)，抑制20?HETE合成對改善大鼠再灌注后心肌具有顯著的保護作用，可有效減少心肌梗死面積的發(fā)生。然而，20?HETE參與IRI的具體作用機制尚待研究。臨床及實驗研究表明，心肌細胞凋亡與IRI的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是再灌注損傷發(fā)病機制中重要環(huán)節(jié)［9］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE可通過線粒體依賴的內源性途徑誘導培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞凋亡［10］。此外，在離體大鼠心肌缺血再灌注模型中研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE可通過增加細胞內活性氧簇生成誘導細胞凋亡，加重再灌注后心肌損傷［2］。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，CaMKII信號通路參與20?HETE誘導的心肌細胞凋亡進程中。結果發(fā)現(xiàn)，20?HETE呈濃度依賴性導致心肌細胞損傷，具有顯著的促進細胞凋亡作用；而應用CaMKII特異性抑制劑——KN?93，阻斷了20?HETE這種作用，提示CaMKII信號通路參與了20?HETE誘導的細胞凋亡，但其中具體機制尚需進一步探究。

圖3 20?HETE對［Ca2+］i影響及KN?93的作用Fig.3 Effects of 20?HETE on［Ca2+］i and the role of KN?93

圖4 20?HETE對RyR2、SERCA2a蛋白表達影響及KN?93的作用Fig.4 Effects of 20?HETE on the expression of RyR2 and SERCA2a and the role of KN?93

Ca2+在心肌細胞的功能與代謝活動中發(fā)揮了關鍵性的調節(jié)作用，它不僅是興奮?收縮耦聯(lián)的重要因子，而且作為第二信使參與細胞凋亡的調控［3-4］，目前已知的細胞凋亡三條途徑中（線粒體途徑、內質網(wǎng)途徑、死亡受體途徑）均與細胞內［Ca2+］i升高引起的Ca2+超載密切相關。因此，為探究20?HETE誘導心肌細胞凋亡機制，本研究首先觀察了20?HETE對心肌細胞的［Ca2+］i影響。結果發(fā)現(xiàn)20?HETE可顯著升高心肌細胞［Ca2+］i，具有誘發(fā)鈣超載作用。在心肌細胞中，收縮期胞漿中Ca2+主要來源于肌漿網(wǎng)鈣庫，RyR2受體通道是釋放鈣庫Ca2+的主要途徑［11］。在舒張期，胞漿內92%Ca2+的清除通過SERCA2a的攝取作用轉運回肌漿網(wǎng)［3］，心肌細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的調控與RyR2和SER?CA2a的功能密切相關。因此，本研究觀察了20?HETE對肌漿網(wǎng)RyR2和SERCA2a表達的影響，探究20?HETE誘導心肌細胞鈣超載機制。結果發(fā)現(xiàn)，20?HETE一方面可以促進RyR2表達升高，其結果引起肌漿網(wǎng)鈣庫釋放Ca2+能力增強；另一方面20?HETE降低了SERCA2a表達，導致舒張期肌漿網(wǎng)對Ca2+回攝能力下降，通過這兩方面機制導致［Ca2+］i升高，誘發(fā)鈣超載。同時發(fā)現(xiàn)，應用KN?93抑制CaMKII作用顯著阻斷了20?HETE誘發(fā)的鈣超載的效應。

CaMKII是機體內重要的蛋白激酶，包括四種亞型，CaMKIIα和CaMKIIβ主要表達于神經(jīng)組織，CaMKIIγ和CaMKIIδ在多種組織中存在，在心臟中主要表達 CaMKIIδ［6］。近年研究表明，CaMKII在心肌肥大、細胞凋亡甚至心衰發(fā)病進程發(fā)揮關鍵作用［12-14］。在心肌細胞凋亡進程中，CaMKII的蛋白表達增高、磷酸化水平增強［13］，而活化的CaM?KII可通過多種途徑調節(jié)細胞內Ca2+平衡，其中肌漿網(wǎng)Ca2+轉運蛋白RyR2和SERCA2a是其重要的下游調節(jié)靶點［3］。CaMKII激活后，一方面通過磷酸化RyR2，增加后者對Ca2+的敏感性，增加肌漿網(wǎng)鈣庫Ca2+釋放；另一方面通過對受磷蛋白（phos?pholamban，PLB）磷酸化，解除其對SERCA2a抑制作用，增強肌漿網(wǎng)對 Ca2+的回攝［5，15］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，20?HETE顯著上調CaMKIIδ蛋白表達，同時提高其Thr287位點磷酸化水平，表明20?HETE具有明顯激活CaMKII的作用，20-HETE通過對CaMKII的激活繼而影響RyR2和SERCA2a功能的改變，從而導致心肌細胞內鈣離子平衡的調節(jié)紊亂，誘發(fā)鈣超載。雖然CaMKII激活后，其直接作用是磷酸化PLB、增強SERCA2a功能，促進Ca2+回攝至肌漿網(wǎng)內，但有研究表明，SERCA2a回攝Ca2+功能還依賴于SERCA2a表達與磷酸化PLB的比率［16］。本研究中發(fā)現(xiàn)20?HETE可降低SERCA2a總蛋白的表達，因此通過減小SERCA2a與PLB的比率，從而降低了SERCA2a回攝Ca2+能力。如上結果表明，20?HETE一方面通過直接影響RyR2和SERCA2a的蛋白表達；另一方面通過激活CaMKII間接影響RyR2和SERCA2a功能，最終導致心肌細胞內Ca2+平衡的紊亂。

近年研究發(fā)現(xiàn)體內多種活性物質，如異丙腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、腎上腺素、內皮素等具有激活CaMKII作用，從而參與相關心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［6，12，17-18］，而本研究中發(fā)現(xiàn)，20?HETE 可上調CaMKII蛋白表達、磷酸化水平增強，表明20?HETE具有顯著激活CaMKII效應，并通過CaMKII介導了其導致的細胞內鈣超載和細胞凋亡作用。雖然20?HETE激活CaMKII的具體機制尚待探明，但我們前期研究發(fā)現(xiàn)，20?HETE具有激活心肌細胞L?型鈣離子通道、增加細胞內Ca2+濃度以及誘發(fā)細胞內 ROS 生成等生物作用［2，19］，細胞內 Ca2+濃度升高是激活CaMKII的必要條件，而細胞內ROS水平增高則可對CaMKII調節(jié)結構域氧化修飾，阻止與催化結構域的重新結合從而保持激酶活性［6］。因此，20?HETE 對心肌細胞內 Ca2+濃度及ROS生成的影響是其激活CaMKII的重要的潛在機制。

綜上所述，以往的研究發(fā)現(xiàn)20?HETE通過誘導心肌細胞凋亡參與IRI進程中，本研究在培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中發(fā)現(xiàn)，20?HETE通過激活CaM?KII，引起肌漿網(wǎng)Ca2+轉運蛋白RyR2和SERCA2a功能改變，導致心肌細胞鈣超載，誘導心肌細胞凋亡，這可能是20?HETE加重IRI損傷的重要機制之一。如上發(fā)現(xiàn)為臨床治療相關的缺血性心肌病以及心衰的藥物治療靶點提供理論依據(jù)與新思路。

圖5 20?HETE對CaMKIIδ表達及磷酸化的影響Fig.5 Effects of 20?HETE on CaMKIIδ protein expression and phosphorylation

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