李新葉，蘇 亮，徐 鈺，江一鳴，宋 捷，翁文采，梁文波＊＊

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 大連 116622；2.大連大學(xué)新華臨床學(xué)院 大連 116000）

西黃丸由牛黃、麝香、乳香、沒(méi)藥四味中藥配伍而成，是抗癌中藥的經(jīng)典名方，現(xiàn)代臨床廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療,其中在乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病和大腸癌等治療中單用或配合放化療可以提高腫瘤患者的存活率及晚期癌癥患者的生活質(zhì)量，改善臨床癥狀[1]。王洪緒所著《外科證治·全生集卷四》提到西黃丸具有清熱解毒、活血化瘀等作用，為外科治療“乳巖”（中醫(yī)將乳腺癌稱為“乳巖”）而設(shè)[2]。故本實(shí)驗(yàn)選取乳腺癌為模型，進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

乳腺癌是導(dǎo)致女性死亡的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[3]。乳腺癌是高度異質(zhì)性的疾病，其與免疫系統(tǒng)的關(guān)系越來(lái)越受到人們的關(guān)注[4]。近年來(lái)腫瘤微環(huán)境的改善被認(rèn)為是治療此類(lèi)腫瘤的方向及靶點(diǎn)[5]。腫瘤微環(huán)境即腫瘤生長(zhǎng)的內(nèi)部環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)外細(xì)胞以及免疫細(xì)胞等組成[6]。“種子（腫瘤細(xì)胞）與土壤（腫瘤微環(huán)境）”假說(shuō)的提出，為腫瘤的生長(zhǎng)不僅取決于其自身的發(fā)展，也離不開(kāi)適合其生長(zhǎng)的土壤這一理論提供依據(jù)[7,8]。腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞與分子處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，其變化的結(jié)果是大量免疫抑制性細(xì)胞（如Treg細(xì)胞）在腫瘤微環(huán)境中大量聚集[9]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一種具有免疫抑制功能的T細(xì)胞，在形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，Treg細(xì)胞數(shù)量的增高與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-12]，在腫瘤免疫中起著負(fù)調(diào)控作用[13]。

本課題組前期通過(guò)高通量篩查發(fā)現(xiàn)，西黃丸對(duì)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用，本研究通過(guò)4T1乳腺癌荷瘤小鼠模型，驗(yàn)證了西黃丸調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)Treg細(xì)胞增殖的影響，探討了其抗腫瘤作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

雌性BALB/c小鼠，體重20±2 g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SCXK（遼）2013-0003。4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥品與試劑

西黃丸，20?！羐-1，每瓶3 g，由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)15042128。EasySepTMMouse CD25Regulatory T cell Postive Selection Kit（STEMCELL，加拿大）；胎牛血清（FBS）（天津?yàn)?，中?guó)）；含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、BCA含量檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液（強(qiáng)）、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、4%多聚甲醛（凱基公司，中國(guó)）；Triton-X-100、TUNEL染色試劑盒（Sigma，德國(guó)）；TBST、TBS、蛋白 Marker、脫脂奶粉（CST，美國(guó)）；一抗：兔抗小鼠β-actin抗體（CST，美國(guó)）、小鼠抗小鼠AKT、兔抗小鼠PI3K（Abcam，美國(guó)），山羊抗小鼠 Foxp3（Novus，美國(guó)）；二抗：驢抗兔抗體（Alexafluor680）、驢抗小鼠抗體（Alexafluor790）（Abcam，美國(guó)），驢抗山羊（Alexafluor488）（Jackson,美國(guó)）；Prolong diamond antifade mountant with dapi（Thermo，美國(guó)）；流式檢測(cè)試劑盒（affymetrix eBioscience，美國(guó)）；小鼠腫瘤浸潤(rùn)組織淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)?，中?guó)）。

1.3 主要儀器

EasySep?磁極（18001，STEMCELL，加拿大）；多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax Plus384，Bio-tek，美國(guó)）；Odyssey雙色紅外激光發(fā)光儀（S/N CLX-0926，LICOR，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD，美國(guó)）；CO2培養(yǎng)箱（NU-5820E，NAURE，美國(guó)）；Dounce（WHEATON，美國(guó)）；Western Blot及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（DYY-6C，北京六一，中國(guó)）；正置熒光顯微鏡BX51、倒置顯微鏡IX73（Olympus，日本）；低溫高速離心機(jī)（CT15RE，Hitachi，日本）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與動(dòng)物模型的建立

用含15%FBS的1640培養(yǎng)基將4T1小鼠乳腺癌細(xì)胞株置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)并收集，用預(yù)熱的PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)×mL-1待用。分別抽取上述濃度細(xì)胞0.2 mL（2×105個(gè)）接種于SPF級(jí)BABL/c小鼠右側(cè)腋下，建立荷瘤小鼠模型，并隨機(jī)分為4組，每組10只。根據(jù)小鼠與人的臨床用藥劑量換算公式計(jì)算給藥劑量，西黃丸三個(gè)劑量組分別為 0.39 g×kg-1（Low）、0.78 g×kg-1（Mid）、1.95 g×kg-1（High）；陰性對(duì)照組（Naive）給予等體積的蒸餾水。自造模后的第二天開(kāi)始ig給藥（2次×d-1），每次0.2 mL，連續(xù)給藥14天，末次給藥當(dāng)晚禁食。第15天脫頸處死小鼠，無(wú)菌剝離腫瘤并置于含有20%胎牛血清的勻漿液的培養(yǎng)皿中，冰上保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抑瘤率的計(jì)算

脫頸處死小鼠，冰上無(wú)菌條件剝離腫瘤組織，稱重并計(jì)算抑瘤率。

2.3 單細(xì)胞懸液的制備

無(wú)菌條件下剝離腫瘤組織，剪碎，于玻璃勻漿器中冰上研磨至單細(xì)胞懸液。200目尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，500 g離心15 min。反復(fù)洗滌，收集細(xì)胞。

2.4 淋巴細(xì)胞分選

用樣本稀釋液調(diào)整細(xì)胞濃度為（2-10）×108個(gè)×mL-1，緩慢轉(zhuǎn)移至含有等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，于水平垂直離心機(jī)500 g離心25 min取白環(huán)層，加10倍體積清洗液，250 g離心10 min洗滌兩次。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的含量

用PBS調(diào)整各組細(xì)胞濃度為2×106個(gè)×mL-1，取50μL單細(xì)胞懸液于EP管中，加入1 μL Anti-Mouse CD16/CD32 室溫避光孵育 15 min，加入 50 μL Anti-Mouse CD4+FITC和Anti-Mouse CD25+APC抗體混合物，4℃避光孵育30 min。加入1.5 mL Flow Cytometry Staining Buffer 600 g離心5 min洗滌兩次。加入1 mL Fixation/permeabilization工作液混勻，室溫避光孵育60 min。加入1 mL 1×permeabilization buffer，600 g離心5 min洗滌兩次。加入100 μL 1×permeabilization buffer重懸細(xì)胞，加入2.5 μL Anti-Mouse mouse/rat Foxp3 PE，室溫條件下避光孵育30 min，加入1 mL 1×permeabilization buffer，600 g離心5 min洗滌兩次。加入300 μL Flow Cytometry staining buffer重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析軟件分析各組間CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例。

2.6 免疫磁珠分選Treg細(xì)胞

用推薦培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108個(gè)×mL-1，按50 μL×mL-1加入 FcR阻攔劑，混勻并室溫孵育5 min。按50 μL×mL-1加入Positive Selectiom Cocktail混勻并室溫孵育10 min。按20 μL×mL-1加入PE Selectiom Cocktail混勻并室溫孵育5 min，按20 μL×mL-1加入RapidSphersTM混勻并室溫孵育5 min。加入推薦培養(yǎng)基混勻并定容至5 mL，放入磁極中室溫孵育5 min，顛倒磁極，倒掉推薦培養(yǎng)基，此步驟重復(fù)4次，管壁中即含有被收集的Treg細(xì)胞，用PBS沖洗管壁，收集細(xì)胞，冰上備用。

2.7 TUNEL染色檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞凋亡

用PBS調(diào)整Treg細(xì)胞濃度為1×107個(gè)×mL-1，取適量細(xì)胞滴于多聚賴氨酸處理的粘附載玻片上。滴加適量4%多聚甲醛，固定1 h，漂洗并晾干。滴加適量0.1%TritonX-100冰上破膜2 min，漂洗。滴加適量TUNEL混合溶液，37℃避光孵育1 h，PBS漂洗。加入免疫染色封閉液，室溫封閉30 min，PBS洗滌。加入山羊抗小鼠Foxp3一抗（1:200稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜孵育，PBS洗滌，加入驢抗山羊（Alexafluor488）二抗（1:200稀釋?zhuān)?，室溫避光孵? h，PBS洗滌。滴加適量DAPI，室溫避光孵育10 min，PBS漂洗，晾干。加入抗熒光猝滅劑并蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果。

2.8 Western Blot檢測(cè)小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞中的PI3K、AKT蛋白表達(dá)

收集Treg細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次后，RIPA裂解液重懸細(xì)胞，劇烈震蕩30 S，冰上靜置4 min，循環(huán)5次，4℃10 000 g離心5 min，取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。蛋白變性煮沸，各組取50 μg蛋白，于8%SDS-PAGE分離后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉1 h，與一抗（1:1000稀釋?zhuān)┙Y(jié)合，4℃搖床過(guò)夜。TBST清洗3次（避光），加入二抗（1:10 000稀釋?zhuān)┦覝乇芄夥跤?0 min。TBST清洗4次（避光）。Odyssey CLX紅外線發(fā)光儀中成像，Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料均采用(±SD)表示，判斷標(biāo)準(zhǔn)以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

與陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示西黃丸中、高劑量組瘤重明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05），見(jiàn)表1。

3.2 對(duì)小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞數(shù)量的影響

與陰性對(duì)照組比較，F(xiàn)ACS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞數(shù)量隨西黃丸劑量的升高而降低（西黃丸低劑量組、西黃丸中劑量組、西黃丸高劑量組VS.陰性對(duì)照組：0.160±0.023、0.113±0.036、0.055±0.019 VS.0.197±0.033），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）（n=6），見(jiàn)圖1。

表1 西黃丸對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響（±SD,n=10）

表1 西黃丸對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響（±SD,n=10）

注：與模型組比較*P＜0.05（下同）。

3.3 Treg細(xì)胞鑒定

我們通過(guò)磁珠分選得到Treg細(xì)胞，且因Foxp3是特異性表達(dá)在Treg細(xì)胞上的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，所以Foxp3抗體免疫熒光染色陽(yáng)性可進(jìn)一步鑒定磁珠分選出的細(xì)胞為T(mén)reg細(xì)胞。DAPI染色細(xì)胞核，F(xiàn)oxp3+特異性染色Treg細(xì)胞，通過(guò)Merge發(fā)現(xiàn)磁珠分選后Treg細(xì)胞染色陽(yáng)性率為可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，詳見(jiàn)圖2。

3.4 對(duì)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞凋亡的影響

與陰性對(duì)照組比較，TUNEL結(jié)果顯示腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞凋亡量隨西黃丸劑量的增加而增加（西黃丸低劑量組、西黃丸中劑量組、西黃丸高劑量組VS.陰性對(duì)照組：699.667±66.464、985.167±126.804、1 609.333±144.882 VS.336.667±34.436），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）（n=6），詳見(jiàn)圖3。

3.5 對(duì)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組比較，Western Blot結(jié)果顯示腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)隨西黃丸劑量的增加而降低（PI3K：西黃丸低劑量組、西黃丸中劑量組、西黃丸高劑量組VS.陰性對(duì)照組：0.669±0.086、0.492±0.072、0.276±0.061 VS.0.760±0.073；AKT：西黃丸低劑量組、西黃丸中劑量組、西黃丸高劑量組VS.陰性對(duì)照組：0.707±0.069、0.495±0.077、0.345±0.058 VS.0.924±0.082），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）（n=6），詳見(jiàn)圖4。

4 討論

圖1 FACS檢測(cè)西黃丸對(duì)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的影響

圖2 藍(lán)色：DAPI為細(xì)胞核；綠色：Foxp3+細(xì)胞；藍(lán)綠色：Merge標(biāo)尺：20 μm

圖3 TUNEL檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞凋亡標(biāo)尺：20 μm

有研究表明，Treg細(xì)胞數(shù)量的增多可促進(jìn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[14-16]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，西黃丸可抑制小鼠乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)，且能降低脾臟中Treg細(xì)胞水平，提高機(jī)體免疫功能[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4T1荷瘤小鼠經(jīng)西黃丸治療后腫瘤生長(zhǎng)被抑制，且抑瘤率與藥物劑量呈正相關(guān)；隨后進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞隨藥量的增加而減少；此外TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞凋亡數(shù)量隨藥量增加而增加。上述結(jié)果說(shuō)明西黃丸抑制了腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，改善腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)，逆轉(zhuǎn)免疫逃逸，從而抑制了腫瘤生長(zhǎng)。

圖4 Western Blot檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞中的PI3K、AKT蛋白表達(dá)

細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生受相關(guān)信號(hào)通路的影響，有研究表明，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡[17,18]。PI3K/Akt通路廣泛存在于細(xì)胞中[19]，PI3K被激活后可使下游蛋白AKT活化，活化后的AKT移動(dòng)到細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核上，作用于不同的靶蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)與繁殖[20]。有研究表明，乳腺癌細(xì)胞凋亡量的增加與PI3K、AKT表達(dá)降低有關(guān)[21]。為了闡明藥物是通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來(lái)減少腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的數(shù)量，在前期，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)基因高通量篩查發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路在藥物干預(yù)后顯著下調(diào)，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，西黃丸治療后使其腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)降低，這說(shuō)明腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞減少的機(jī)制與Treg細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)降低有關(guān)，進(jìn)而闡明了西黃丸這一經(jīng)典名方的抗腫瘤作用機(jī)制。

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