李 甜，周錢梅，張衛(wèi)紅

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院乳腺科 上海 201900；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)復(fù)雜系統(tǒng)研究中心 上海 201203）

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年全球女性新發(fā)乳腺癌有167萬例，同一時(shí)期，約有52萬例女性患者死亡，占女性癌癥死亡率的首位***。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中一種特殊的類型，是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor-2，Her-2)表達(dá)均為陰性的乳腺癌，因缺乏相應(yīng)的醫(yī)治靶點(diǎn)，故死亡率較其他類型乳腺癌高[1]。臨床上，中醫(yī)藥作為乳腺癌綜合治療的重要方法之一，在三陰性亞型中的干預(yù)顯得尤為重要。

全國名老中醫(yī)陸德銘教授在五十年診治乳腺癌的臨床實(shí)踐中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，陸老認(rèn)為乳腺癌的主要病機(jī)為：本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，因此提倡使用“益氣扶正”之法來治療該疾病[2]，其創(chuàng)制的“乳癌術(shù)后方”被證實(shí)可以明顯降低ER陰性患者無病生存率[3]，方中君藥“黃芪”，李時(shí)珍言“黃芪為補(bǔ)藥之長”，為益氣扶正法的代表藥，既能健脾消痰，又能補(bǔ)氣活血，助邪外出，有效防治乳腺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。陸教授在臨證中用黃芪扶正時(shí)還常選配黨參，《本草從新》記載黨參：“補(bǔ)中益氣、和脾胃、除煩渴。”前期研究發(fā)現(xiàn)以“黃芪、茯苓”為主要成分的“益氣扶正小復(fù)方”與特羅凱（一種表皮生長因子受體EGFR酪氨酸激酶抑制劑）聯(lián)合使用能通過下調(diào)p-EGFR、p-Akt1，上調(diào)PTEN的表達(dá)顯著抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-468的細(xì)胞增殖[4]。

目前研究已明確PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在TNBC中的發(fā)生發(fā)展中有著非常重要的作用[5]，因此我們此次研究，選用益氣復(fù)正大法中的“黃芪、黨參”為主要藥物，制備成益氣復(fù)正復(fù)方（復(fù)方）與mTOR抑制劑依維莫斯分別及聯(lián)合作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞，查看其對細(xì)胞的增殖抑制作用及對Akt/mTOR信號(hào)通路的影響。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

黃芪、黨參購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，DEME高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、牛胰島素（Insulin）均購自美國Sigma公司；Annexin V/碘化丙啶（PI）試劑盒購自美國Beckman Coulter公司；抗體GAPDH及二抗購自康成生物；IRDyeTMfluorescence an?tibodies（美國LI-COR Bioscience公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫CO2細(xì)胞培育箱(Thermo Forma公司)；低溫高速離心機(jī)(KUBOTA公司)，Synergy2酶標(biāo)儀(Biotek公司)；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)，TH4-200相差顯微鏡(OLYMPUS公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀MK3(Thermo Labsystems公司)；Odyssey雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)(LICOR公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞購于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。在含10%胎牛血清、0.01%mg?mL-1牛胰島素、100U ?L-1青霉素和 10 mg?mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培殖MDA-MB-468細(xì)胞，37℃、5%CO2恒溫?zé)o菌養(yǎng)育箱中生長，每兩天觀察貼壁情況并換液。待細(xì)胞生長至80-90%時(shí)，0.25%胰酶消化后按比例傳代。選取對數(shù)生長期的MDA-MB-468人乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 高效液相色譜法（HPLC）制備益氣扶正復(fù)方藥物

對益氣扶正中藥（黃芪：黨參=10∶6）復(fù)方進(jìn)行提取、濃縮、干燥，以黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、黨參多糖、歐前胡索等成分含量為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜法（HPLC）制定提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，按此標(biāo)準(zhǔn)制備益氣扶正中藥復(fù)方。益氣小復(fù)方藥物干粉由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心制備，對飲片質(zhì)量、提取工藝、濃縮工藝和干燥工藝進(jìn)行考察，以益氣小復(fù)方藥物黃芪、黨參按照2∶1的比例，加水回流提取3次，加水量為10倍，8倍，8倍，提取時(shí)間分別為1.5，1，1 h，濾過，濾液合并后減壓濃縮，真空干燥，粉碎至中粉。采用高效液相法對所制備的益氣小復(fù)方水提取物粉末進(jìn)行有效成分（黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黨參炔苷）含量進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。本藥物共使用5 kg生藥藥物，共制備獲取250 g藥物，每1 g粉末相當(dāng)于生藥20 g。藥物于本實(shí)驗(yàn)室干燥器內(nèi)保存。

2.3 細(xì)胞增殖檢測

MTT法觀察細(xì)胞增殖情況，將人乳腺癌MDAMB-468細(xì)胞接種于96孔板（1×104個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24小時(shí)至細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，分別運(yùn)用10，20，40，80，160 mg·mL-1益氣扶正中藥（復(fù)方）干預(yù)細(xì)胞12，24，48 h，每一濃度做4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性空白對照孔（只含細(xì)胞、培養(yǎng)液）；配置0.5%MTT溶液，每孔加20μL，37℃溫育4 h后棄上清液，加入二甲基亞砜DMSO（150 μl/孔），震蕩10 min使其充分溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長490 nm處測得各孔OD值，檢測量效關(guān)系。計(jì)算復(fù)方藥物對細(xì)胞生長的抑制率，并繪制效應(yīng)曲線，同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算公式：細(xì)胞生存率(%)=(OD藥物組－OD空白對照)/(OD藥物組－OD空白對照)×100%。用SPSS21.0軟件擬合估計(jì)IC50值。同樣的方法，運(yùn)用1，10，100，1 000 nmol?L-1依維莫司（Everoli?mus）干預(yù)細(xì)胞12，24，48 h，觀察其對細(xì)胞增殖的抑制作用，計(jì)算IC50值。用IC50濃度的復(fù)方40 mg?mL-1與Everolimus100 nmol?L-1單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞48 h，用Q值[6]估算合并用藥的效果，判斷是否存在協(xié)同作用，Q(%)=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)×100%，其中Ea+b為兩藥聯(lián)用組的增殖抑制率，Ea、Eb分別為復(fù)方 40 mg·mL-1、Everolimus100 nmol·L-1對 MDA-MB-468細(xì)胞的增殖抑制率，Q值若在0.85-1.15為單純相加，若Q＞1.15為有協(xié)同作用，Q＜0.85為拮抗。

2.4 細(xì)胞周期檢測

運(yùn)用復(fù)方的IC50濃度作用MDA-MB-468細(xì)胞，48 h后收集各藥物干預(yù)后的細(xì)胞，胰酶消化，1000 r·min-1離心2 min，吸除上清液，PBS洗滌2遍，再次離心2 min，1 000 r·min-1后提取細(xì)胞，加70%冰乙醇固定，4℃靜置一夜。取出固定的標(biāo)本，離心1 500 r·min-1，5 min，棄去上清，加PBS洗滌細(xì)胞2遍，離心1 500 r·min-1，離心5 min，PBS洗2遍。再加入PI染液室溫避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀，使用Mcycle軟件檢測分析細(xì)胞周期。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測

同樣方式處理細(xì)胞，參照Annexin-v/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒方法實(shí)驗(yàn)，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.6 Western blot

提取各實(shí)驗(yàn)組蛋白（復(fù)方40 mg·mL-1，Everolimus 100 nmol·L-1，復(fù)方+Everolimus），Bradford法定量后制備樣品，Western blot法檢測mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt、PETEN及GAPDH蛋白的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。將等量蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉1 h后，棄去封閉液，加入一抗，封入雜交袋內(nèi)，4℃搖蕩過夜。PBST清洗3次后，加入熒光二抗（1∶10000稀釋)，避光培育1 h，PBST洗滌3次，加入化學(xué)底物助其顯影、Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)讀膜，分析各條帶灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 益氣扶正復(fù)方對乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞生長的影響

為了觀察復(fù)方對MDA-MB-468細(xì)胞增殖的影響，我們運(yùn)用復(fù)方于不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 1-3 所示，在 12，24，48 h，復(fù)方 10，20，40，80，160 mg·mL-1呈劑量依賴性地抑制了MDA-MB-468細(xì)胞增殖。干預(yù)細(xì)胞48h時(shí)復(fù)方的IC50濃度為40mg·mL-1。分別運(yùn)用依維莫司（Everolimus）1，10，100，1 000 nmol·L-1干預(yù)細(xì)胞12，24，48 h，Everolimus呈劑量、時(shí)間依賴性地抑制了MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞增殖。其48 h的IC50濃度約為 100 nmol·L-1。分別運(yùn)用IC50濃度的復(fù)方40 mg·mL-1與Everolimus100 nmol·L-1單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞48 h，復(fù)方與Everolimus聯(lián)合運(yùn)用致MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞存活率降低至34%，并且兩藥合用Q值為43.89＞1.15，表明兩藥有協(xié)同作用，結(jié)果如圖4-5所示，兩藥合用提高了其對MDA-MB-468三陰性乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。

圖1 復(fù)方對MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞存活率的影響

圖2 Everolimus對MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞存活率的影響

表1 各藥物組與空白藥物對照組比較

圖3 益氣扶正中藥復(fù)方聯(lián)合Everolimus對MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞存活率的影響

表2 益氣扶正中藥復(fù)方單用、Everolimus單用與兩藥聯(lián)合使用比較

3.2 益氣扶正中藥復(fù)方對乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞凋亡的影響

分別運(yùn)用IC50濃度的復(fù)方40 mg·mL-1與Everolimus 100 nmol·L-1干預(yù)MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞48 h，觀察其對細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，單獨(dú)運(yùn)用復(fù)方 40 mg·mL-1和 Everolimus 100 nmol·L-1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率分別為20%、26%，而聯(lián)合運(yùn)用后細(xì)胞凋亡率增至41%。

3.3 益氣扶正中藥復(fù)方對乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞周期的影響

分別運(yùn)用IC50濃度的復(fù)方40 mg·mL-1與Everolim?us 100 nmol·L-1干預(yù)MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞48 h，觀察其對細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，與空白對照比較，復(fù)方40 mg·mL-1致S期細(xì)胞減少了18%，而Everolimus 100 nmol·L-1和聯(lián)合用藥分別致G2/M期和S期減少了11%和15%。

3.4 益氣扶正中藥復(fù)方對乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

圖4 益氣扶正中藥復(fù)方聯(lián)合Everolimus對MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

圖5 益氣扶正中藥復(fù)方聯(lián)合Everolimus對MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞周期的影響

表3 益氣扶正中藥復(fù)方聯(lián)合Everolimus對MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞周期的影響

分別運(yùn)用IC50濃度的復(fù)方40 mg·mL-1與Everolimus 100 nmol·L-1干預(yù)乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞48 h，觀察其對細(xì)胞Akt/mTOR信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞中mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt均呈高表達(dá)趨勢，復(fù)方40 mg·mL-1與Evero?limus 100 nmol·L-1聯(lián)用顯著抑制了p-mTOR和p-Akt的活性，提高了PTEN的表達(dá)；而單獨(dú)運(yùn)用復(fù)方40 mg·mL-1則顯著提高了PTEN的表達(dá)，同時(shí)抑制了p-mTOR和p-Akt的活性。

4 討論

圖6 益氣扶正中藥復(fù)方對MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞Akt/mTOR信號(hào)通路的影響

全國名老中醫(yī)陸德銘教授在五十年診治乳腺癌的臨床實(shí)踐中創(chuàng)制了益氣扶正大法。黨參聯(lián)合黃芪，能使黃芪益氣化痰散濁作用增強(qiáng)?，F(xiàn)代中藥藥理研究[4]，黃芪作為益氣扶正法的代表藥，其抗腫瘤機(jī)制則主要是通過正向調(diào)節(jié)機(jī)體的功能，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用。陸教授臨床中使用黃芪扶正同時(shí)還常選配黨參，以黃芪、黨參為主的益氣扶正復(fù)方具有顯著的臨床療效[7]，但其作用機(jī)制尚不明確。

我們此次研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方單獨(dú)作用于三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞株，對其有增殖抑制作用，復(fù)方與m-TOR抑制劑Everolimus聯(lián)用具有協(xié)同作用，對細(xì)胞的增殖抑制作用更為明顯。前期研究發(fā)現(xiàn)，以黃芪、茯苓為主要成分的益氣小復(fù)方對于三陰性乳腺癌MDAMB-231移植瘤有一定的抑瘤作用，益氣小復(fù)方聯(lián)合特羅凱，能提高特羅凱抑瘤作用[8]。這提示了以益氣復(fù)藥物對三陰性乳腺癌有抑制其增殖作用，而與西藥聯(lián)用抑瘤作用更為顯著，我們以上實(shí)驗(yàn)只選取了黃芪、黨參或黃芪、茯苓作為益氣復(fù)正代表藥物，而聯(lián)用的西藥則分別為Everolimus和特羅凱，是否以益氣復(fù)正為主要作用的其它藥物復(fù)方也能有類似的抑瘤作用，與其他抗腫瘤西藥聯(lián)用是否也存在協(xié)同作用，還有待后續(xù)探討。

我們實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，復(fù)方40 mg·mL-1致S期細(xì)胞減少了18%，而Everolimus 100 nmol·L-1和聯(lián)合用藥分別致G2/M期和S期減少了11%和15%，其機(jī)制有可能與復(fù)方能將細(xì)胞阻滯于G0/G1期有關(guān)。關(guān)于細(xì)胞周期的阻滯作用，有文獻(xiàn)報(bào)道黃芪含藥血清抑制了乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期[9]；黨參通過將細(xì)胞阻滯于G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用[10]。王萌等發(fā)現(xiàn)[11]明黨參根皮5種呋喃香豆素對人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231表現(xiàn)出不同程度的增殖抑制作用，具有明顯的抗腫瘤活性。而黃芪的有效成分之一芒柄花素也被證實(shí)可通過減少乳腺癌細(xì)胞G1/S期正調(diào)控因子cyclin D1和cy?clin E的基因和蛋白表達(dá)，促進(jìn)負(fù)調(diào)控因子p21和p27的基因和蛋白表達(dá)，從而將乳腺癌細(xì)胞阻滯于G1期，進(jìn)而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞增殖目的[12]。我們此次的研究進(jìn)一步證實(shí)了以黃芪和黨參為主要藥物的復(fù)方能將細(xì)胞阻滯于G0/G1期。

PI3K/Akt/mTOR作為細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，普遍存在于細(xì)胞中。該通路過度激活后可促進(jìn)細(xì)胞過度增殖、抑制細(xì)胞凋亡、促使細(xì)胞分化異常以及參與細(xì)胞自噬等導(dǎo)致腫瘤形成和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。在我們前期對益氣扶正法代表藥黃芪及其成分的實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)黃芪注射液和黃芪有效成分芒柄花素、黃芪甲苷都能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[14]，可以上調(diào)一些能抑制Akt磷酸化的相關(guān)抑癌基因，如能上調(diào)PTEN的基因和蛋白水平從而抑制p-Akt(Thr308)的表達(dá)，能上調(diào)PP2A的基因和蛋白水平從而抑制p-Akt(Ser 473)的表達(dá)[15]。前期研究還發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的增殖，下調(diào)MDA-MB-468細(xì)胞Akt磷酸化的水平，其抑制MDA-MB-468細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與通過對MDM2正負(fù)反饋環(huán)的調(diào)節(jié)從而上調(diào)p53和PTEN蛋白的表達(dá)有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方40 mg·mL-1單獨(dú)及與Everolimus 100 nmol·L-1聯(lián)用都能抑制p-mTOR和p-Akt的活性，提高了PTEN的表達(dá)，說明復(fù)方及復(fù)方與Everolimus聯(lián)用也可能通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白抑制乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞生長。

綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方對乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞增殖呈時(shí)間、劑量依賴性地抑制，復(fù)方與Everolimus聯(lián)用增殖抑制效果更為顯著，其機(jī)制可能與其能將乳腺癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期、抑制p-mTOR和p-Akt的活性，提高PTEN的表達(dá)有關(guān)。

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