余森，楊杰，張繼航，黃嵐

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，主要參與了受損內(nèi)皮的修復(fù)。EPCs從骨髓、脾臟等部位動員、遷移、歸巢至血管損傷部位，在多種激素或細(xì)胞因子刺激下分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)從而修復(fù)損傷血管，其作用在急性心肌梗死、缺血再灌注損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變、肢體缺血等血管病變中均有報道[1]。然而傳統(tǒng)以EPCs移植為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療，在移植后普遍面臨缺血缺氧等惡劣環(huán)境[2]，這導(dǎo)致移植后細(xì)胞存活率較低，制約了EPCs移植向臨床的轉(zhuǎn)化。因而明確EPCs在缺血缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下的存活機制，對提高移植治療效果、加強病理狀態(tài)下的血管修復(fù)有積極的指導(dǎo)作用。自噬(autophagy)作為真核細(xì)胞降解胞內(nèi)蛋白、細(xì)胞器的重要方式，對干細(xì)胞的發(fā)育、分化、存活和歸巢都有重要作用[3-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)自噬對氧化應(yīng)激下EPCs的增殖存活發(fā)揮了保護作用[5]，但缺氧環(huán)境下自噬對EPCs遷移、凋亡等過程有何作用還有待研究。因此，本實驗旨在觀察缺氧環(huán)境下自噬對EPCs遷移及凋亡的影響，初步探討自噬在其中發(fā)揮的作用，為缺氧環(huán)境下EPCs移植修復(fù)血管提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，EGM-2MV培養(yǎng)基購自瑞士Lonza公司，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體、自噬相關(guān)蛋白-7(Atg7)抗體、SQSTM1(p62)抗體購自美國Cell Signal Technology公司，β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自美國Santa Cruz公司，淋巴細(xì)胞分離液購自美國Sigma公司，Annexin V-PE和7-AAD染液購自中國凱基生物技術(shù)公司。Transwell小室(Corning公司，美國)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Kendro公司，美國)；激光共聚焦顯微鏡(Leica公司，德國)；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司，美國)。

1.2 EPCs的分離鑒定及培養(yǎng) 成年雄性SD大鼠由新橋醫(yī)院實驗動物中心提供。取大鼠脛、腓骨，PBS沖洗后收集骨髓腔沖洗液，密度梯度離心后將分離出的細(xì)胞接種于EGM-2MV的培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)。為證實EPCs的表型，我們采用熒光雙染法鑒定EPCs，在培養(yǎng)的細(xì)胞中依次加入DiI-acLDL和FITC-UEA-I，通過流式細(xì)胞術(shù)雙染陽性被確定為EPCs。

1.3 缺氧處理EPCs及分組 分離培養(yǎng)的EPCs每隔24h換液1次，待細(xì)胞密度為80%時，常規(guī)進行消化傳代。為檢測缺氧對EPCs遷移、凋亡及自噬水平的影響，我們將細(xì)胞分為4組：常氧培養(yǎng)組(即缺氧0h組)，缺氧1h組，缺氧3h組和缺氧6h組；為檢測缺氧環(huán)境下自噬對EPCs的作用，我們將細(xì)胞分為4組：常氧培養(yǎng)組(即缺氧0h組)，缺氧3h組，缺氧3h+沉默Atg7(ShAtg7)組和ShAtg7組。常氧培養(yǎng)條件為：37℃、5%CO2、21%O2、74%N2常氧培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，缺氧培養(yǎng)條件為：37℃、5%CO2、1%O2、94%N2低氧培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率 按前述實驗分組處理EPCs后，收集各組細(xì)胞上清液于對應(yīng)離心管，PBS洗滌1次后用胰酶消化貼壁細(xì)胞1min，加入完全培養(yǎng)基終止消化，收集培養(yǎng)液與對應(yīng)組的上清液細(xì)胞混合，1000×g離心3min，PBS洗滌2次后制備細(xì)胞懸液，加Annexin V-PE(AV-PE)和7-AAD染色，流式細(xì)胞儀檢測各組EPCs凋亡率。

1.5 Western blotting檢測 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液，離心后提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定樣本蛋白質(zhì)濃度。按每泳道50μg上樣量，進行10% SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，加入一抗在4℃條件下孵育過夜(一抗采用LC3、p62和β-actin，1:1000)，TBST洗滌3次，加入二抗標(biāo)記有辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1:5000)，37℃室溫孵育1h，TBST洗滌3次，ECL顯影，利用Image J軟件進行半定量分析。

1.6 自噬相關(guān)蛋白Atg7沉默 慢病毒載體(LV) Atg7 shRNA由漢恒生物技術(shù)(上海，中國)構(gòu)建。在骨髓來源的單核細(xì)胞(BMNCs)播種2d后，按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100加入病毒。轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)基在48h后換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。Western blotting檢測分為空白對照組(control)、空載組(vector control，VC)及ShAtg7組，以期驗證EPCs中Atg7的敲減效率。

1.7 Transwell侵襲小室實驗 取對數(shù)生長期的EPCs，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個/ml，在鋪好膠的上室中加入200μl細(xì)胞懸液(不含血清)，下室加入500μl含VEGF的EGM-2培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔，按前述實驗分組對EPCs進行孵育。孵育結(jié)束后從小室取出各組EPCs，4%多聚甲醛固定10min，PBS洗滌細(xì)胞3次，結(jié)晶紫染色10min，倒置顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞數(shù)并拍照，隨機選擇視野進行統(tǒng)計分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，實驗重復(fù)≥3次。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧對EPCs遷移能力的影響 取缺氧0、1、3、6h分組處理EPCs后，利用經(jīng)典的Transwell小室遷移實驗比較各組EPCs遷移能力的變化。結(jié)果顯示，隨著低氧暴露時間的延長，EPCs遷移能力逐漸降低。常氧培養(yǎng)組(即缺氧0h組)，顯微鏡下平均每視野EPCs為50.6±5.2個，缺氧培養(yǎng)3h后平均每視野EPCs減少為36.60±3.36個(P<0.05)，缺氧培養(yǎng)6h后平均每視野EPCs進一步減少為28.80±4.38個(P<0.05，圖1)。

2.2 缺氧對EPCs凋亡的影響 我們用Annexin V-PE(AV-PE)和7-AAD雙染色標(biāo)記細(xì)胞，并采用流式細(xì)胞儀檢測各組EPCs凋亡水平。結(jié)果顯示，隨著低氧暴露時間的延長，EPCs凋亡率逐漸升高。常氧培養(yǎng)組(即缺氧0h組)凋亡率為3.87%±0.55%，缺氧3h后凋亡率(6.85%±0.91%)明顯升高(P<0.05)，缺氧6h后凋亡率(9.60%±0.78%)較缺氧0h組進一步升高(P<0.05)，與缺氧3h組相比凋亡率也有明顯升高(P<0.05，圖2)。

圖1 缺氧對EPCs遷移的影響(Transwell小室)Fig.1 Influence of hypoxia on EPCs migration (Transwell chambers)

圖2 缺氧對EPCs凋亡的影響(流式細(xì)胞儀)Fig.2 Influence of hypoxia on EPCs apoptosis (Flow cytometry)

2.3 缺氧對EPCs自噬的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，隨著缺氧時間的延長，EPCs自噬關(guān)鍵蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化增加，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增大，在缺氧3h后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，自噬泛素化底物p62逐漸減少，在缺氧3h后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。根據(jù)遷移和凋亡結(jié)果，結(jié)合文獻[6]報道，后續(xù)研究我們采用1%氧濃度培養(yǎng)3h作為缺氧模擬條件。

2.4 缺氧激活的自噬在EPCs遷移和凋亡中作用我們采用慢病毒轉(zhuǎn)染方式穩(wěn)定沉默自噬蛋白Atg7，Western blotting驗證Atg7被成功敲除，空載組(vector-control，VC)Atg7表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達變化證實沉默Atg7后自噬被成功抑制(圖4A、B)。我們再次利用流式細(xì)胞儀分析抑制自噬后細(xì)胞凋亡率的改變，結(jié)果顯示，缺氧3h組EPCs凋亡率(6.68%±0.95%)與缺氧0h組(3.45%±0.79%)比較明顯升高(P<0.05)；缺氧3h+ShAtg7組EPCs凋亡率(8.41%±1.08%)與缺氧3h組相比，凋亡率進一步升高(P<0.05，圖4C、D)。

同時，我們利用Tanswell小室再次檢測抑制自噬后細(xì)胞遷移數(shù)目的改變，結(jié)果顯示，缺氧3h組EPCs遷移數(shù)目(34.00±3.53)明顯低于缺氧0h組(47.80±7.50，P<0.05)，缺氧3h+ShAtg7組EPCs遷移數(shù)目(23.60±3.51)與缺氧3h組相比，EPCs遷移數(shù)目進一步減少(P<0.05，圖5)。

圖3 缺氧對EPCs LC3-Ⅱ/Ⅰ及p62表達的影響(Western blotting)Fig.3 Influence of hypoxia on the expressions of LC3-Ⅱ/Ⅰ and p62 (Western blotting)

圖4 沉默Atg7表達后缺氧對EPCs凋亡的影響Fig.4 Influence of hypoxia on EPCs apoptosis after silencing Atg7 expression

圖5 沉默Atg7表達后缺氧對EPCs遷移的影響(Transwell小室)Fig.5 Effects of hypoxia on EPCs migration after silencing Atg7 expression (Transwell chamber)

3 討 論

本研究結(jié)果表明，缺氧環(huán)境下大鼠骨髓來源的EPCs遷移能力下降，細(xì)胞凋亡率升高，同時，缺氧使EPCs內(nèi)LC3-Ⅱ/Ⅰ表達增高，p62表達降低，證實缺氧是自噬的重要激活因子[7]。沉默Atg7抑制自噬后發(fā)現(xiàn)，與缺氧3h組比較，缺氧3h+ShAtg7組的EPCs遷移能力進一步降低，細(xì)胞凋亡率進一步升高，說明自噬在缺氧造成的損傷中發(fā)揮了保護作用。EPCs遷移和凋亡都受到自噬的影響，因此，缺氧在抑制EPCs遷移、增加細(xì)胞凋亡的同時，激活的自噬可降低缺氧對EPCs的損傷，恢復(fù)部分EPCs遷移并減少凋亡，增加EPCs的存活率。

在人體的大部分組織中，氧濃度低于3%被視為是一種低氧環(huán)境[8]，本研究采用的是1%氧濃度的低氧培養(yǎng)箱處理細(xì)胞，由于長期缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，使自噬作用難以體現(xiàn)，因此本研究采用短期缺氧處理1、3、6h后觀察EPCs遷移能力及凋亡數(shù)目變化。文獻報道處于胚胎期及骨髓內(nèi)的EPCs常處在低氧狀態(tài)[9]，當(dāng)血管受損等發(fā)生時，EPCs動員至損傷處分化為內(nèi)皮細(xì)胞，缺氧可以明顯增強缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、趨化因子受體4(CXCR4)、VEGF等因子的表達，從而提高EPCs遷移、分化、增殖能力[6]，因此缺氧預(yù)處理EPCs可增強細(xì)胞的抗凋亡能力。但是，缺氧預(yù)處理對EPCs生物學(xué)功能影響的最佳時間條件不甚明確，這可能與體內(nèi)缺氧環(huán)境有多種神經(jīng)體液調(diào)節(jié)共同作用有關(guān)。本實驗中，使用1%氧濃度缺氧處理3h后即對EPCs的遷移及凋亡產(chǎn)生明顯影響，說明體外環(huán)境下短期低氧處理即可激活EPCs凋亡通路并抑制遷移相關(guān)蛋白，使EPCs遷移能力減弱，凋亡增加。

自噬作為一種應(yīng)激調(diào)控機制，在維持細(xì)胞正常功能中發(fā)揮著重要作用。既往研究表明適度激活的自噬可促進清除損傷的細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物及突變基因，以延長細(xì)胞壽命[10]。近年來自噬與心血管疾病的聯(lián)系逐漸受到關(guān)注，尤其在缺氧缺血性血管疾病、缺血再灌注損傷[7,11]等疾病中受到廣泛研究，但自噬對于缺氧環(huán)境下EPCs的作用還有待進一步研究。目前關(guān)于缺氧激活細(xì)胞自噬的途徑主要集中在對HIF-1α的研究上[12]，HIF-1α被認(rèn)為是缺氧激活自噬的始動因子。Wang[13]的研究指出，由HIF-1α介導(dǎo)的自噬可增加細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)，并且這種損傷可被自噬抑制劑3-MA所阻斷。BNIP3/BNIP3L是缺氧誘導(dǎo)自噬發(fā)生的重要分子，缺氧時HIF-1α能使BNIP3/BNIP3L表達增加，競爭性地使Beclin-1從Bcl-2/Beclin-1復(fù)合體中解離并釋放，Beclin-1通過PI3K/AKT途徑調(diào)節(jié)下游多種自噬相關(guān)蛋白，從而激活缺氧誘導(dǎo)的自噬[11]。另外嚴(yán)重的缺氧可造成細(xì)胞內(nèi)線粒體畸形和損傷，使線粒體內(nèi)鈣超載，同時產(chǎn)生并釋放活性氧(ROS)、細(xì)胞色素C等物質(zhì)，上調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白酶(caspase)，促進細(xì)胞凋亡或壞死[14]，而自噬能清除受損線粒體及蛋白質(zhì)，降低ROS細(xì)胞毒性，并維持細(xì)胞內(nèi)能量穩(wěn)定。上述為缺氧激活細(xì)胞自噬過程中可能存在的幾種途徑，在EPCs中仍有待進一步研究。

缺氧激活的自噬與細(xì)胞凋亡及遷移聯(lián)系緊密。研究發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下AKT和NF-κB通路對調(diào)控EPCs遷移和內(nèi)皮分化發(fā)揮著重要作用[15]，同時細(xì)胞自噬與凋亡存在共同通路，例如通過PI3K/AKT/mTOR途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與自噬，且PI3K/AKT/eNOS途徑對EPCs動員、遷移及分化都發(fā)揮著重要作用[16]。適度的低氧可激活自噬，清除細(xì)胞內(nèi)的變形蛋白及衰老細(xì)胞器并提供細(xì)胞代謝所需的原材料，促進細(xì)胞在缺氧環(huán)境下的生存。然而，當(dāng)缺氧暴露時間持續(xù)延長或程度加重時，自噬將被過度激活，細(xì)胞將出現(xiàn)自我消化，進一步導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡或者凋亡[17-18]。因此，自噬作為一把雙刃劍，在保護細(xì)胞的同時也可能對細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。在本研究中，我們并未采用傳統(tǒng)自噬誘導(dǎo)劑如mTOR抑制劑(雷帕霉素)、IP3R阻滯劑[19](Xestospongin C)，因為此類自噬誘導(dǎo)劑常造成細(xì)胞自噬激活過度，引起細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器及蛋白過度降解，導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡或者凋亡的發(fā)生[20]，從而掩蓋自噬對細(xì)胞的保護性作用。在后續(xù)的研究中，我們將進一步篩選及探討激活自噬的藥物，通過調(diào)控適度的自噬從而達到保護應(yīng)激環(huán)境下EPCs生物學(xué)功能的作用。

綜上所述，本研究證實，缺氧可減弱EPCs的遷移能力并增加細(xì)胞凋亡，同時可激活EPCs自噬。通過適度正向調(diào)控EPCs自噬，可增強細(xì)胞遷移、抑制凋亡，從而提高EPCs生存能力。該結(jié)果將有助于為缺血再灌注損傷、缺血缺氧性心血管病等疾病治療提供一種新的策略，也為后續(xù)的深入實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

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