張朝寧，李金田，劉永琦，藺興遙，孫少伯，李娟，李雪燕

重離子(12C6+)被譽為21世紀最理想的腫瘤放療用射線，但在臨床上用重離子束照射腫瘤部位時，病灶周圍未受到直接照射的細胞會接受已照射細胞釋放的損傷信號產(chǎn)生輻射旁效應(yīng)[1]，包括DNA損傷、細胞增殖或凋亡、基因表達改變、表觀遺傳學(xué)改變、炎癥反應(yīng)、致瘤性轉(zhuǎn)化甚至癌癥形成等[2-4]。輻射旁效應(yīng)的防護是輻射生物學(xué)和臨床癌癥治療領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。中藥因資源豐富、毒副作用小、整體調(diào)治、防治結(jié)合等優(yōu)點，目前已成為輻射防護劑的研究熱點[5-7]。歸芪益元膏源自《醫(yī)學(xué)心悟》之黃芪湯[8]，加甘肅道地藥材當(dāng)歸而成，全方具有益氣滋陰、養(yǎng)血活血之效。本實驗探討重離子輻射誘發(fā)體內(nèi)旁效應(yīng)中caspase-3、caspase-9基因表達的變化以及歸芪益元膏的干預(yù)作用，以期為重離子輻射旁效應(yīng)損傷的中醫(yī)藥防護提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；DAB試劑盒、抗體稀釋液、免疫組化SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；兔抗caspase-3多抗(美國ImmunoWay公司)；兔抗caspase-9抗體(美國博奧森生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Fast qPCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；引物設(shè)計合成(上海生工生物工程有限公司)。D37520型低溫高速離心機(德國Kendro公司)；PRO200型組織勻漿器(美國Bio-Gen公司)；041BR109973型電泳儀、C1000型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；M-2016型石蠟切片機、TECVEM-J2型石蠟包埋機、VIP-5JR-J2型自動組織脫水機(德國Leica 公司)。

1.2 藥品制備 歸芪益元膏組成：黃芪30g，當(dāng)歸、熟地、麥冬、人參、枸杞子各15g，五味子10g。方中原藥材由甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量控制實驗室提供并進行質(zhì)量鑒定，鑒定人為魏舒暢教授。歸芪益元膏制備(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥實驗室)：按處方劑量稱取藥材，以水作溶劑提取兩次，第1次用水量為總藥材劑量的8倍，第2次為總藥材劑量的6倍，每次提取2h；合并兩次提取的藥液，300目濾布過濾，濾液減壓濃縮后加制劑輔料(防腐劑、增稠劑等)制成膏劑，膏劑濃度為1.64g/ml。

1.3 實驗動物及分組 SPF級雄性Wistar大鼠42只，體重200±20g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)S P F級實驗動物中心提供并飼養(yǎng)[合格證號SCXK(甘)2015-0002]。采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、單純輻射組(RO組)，中藥組(CM組)，后兩組按照射后處死時間再分為6、12、24h亞組，每組6只。中藥組以歸芪益元膏灌胃2周，灌胃劑量按照體表面積折算法，大鼠每日給藥劑量約為人臨床用量的10倍，即3.28g/(kg.d)，NC組和RO組以等量生理鹽水灌胃。

1.4 動物照射 照射前大鼠腹腔注射10%水合氯醛(劑量0.3ml/100g)麻醉。RO組和CM組大鼠右肺給予2Gy12C6+離子束單次照射，鉛皮屏蔽身體其余部位，NC組給予相同方式麻醉，但不照射。重離子照射在中國科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子加速器研究裝置的淺層腫瘤治療終端上進行，束流為12C6+離子束。坪區(qū)照射，能量為165MeV，LET為20keV/μm，吸收劑量率為2Gy/min，用空氣電離室監(jiān)測劑量，照射劑量為2Gy。

1.5 標本采集 照射后6、12、24h處死各組大鼠，取出右肺、左肺、左腎，冰生理鹽水沖洗，一部分以液氮快速冷卻后分別放入無酶凍存管，–80℃凍存；另一部分用4%多聚甲醛固定。

1.6 RT-qPCR檢測肺腎組織caspase-3、caspase-9 mRNA水平 采用Trizol法從肺、腎組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，進行qPCR，引物序列見表1。反應(yīng)體系：SYBR Fast qPCR Mix(2×)12.5μl，引物2μl，cDNA 2μl，加滅菌蒸餾水至25μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，然后95℃ 5s、60℃ 10s，循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參，用2–ΔΔCt法進行相對定量分析。

表1 各目的基因及內(nèi)參引物序列Tab.1 Primer sequences of target genes and reference gene

1.7 免疫組化檢測肺腎組織caspase-3、caspase-9蛋白水平 常規(guī)石蠟包埋各組大鼠肺腎組織，切片厚度4μm，經(jīng)脫蠟、水化、修復(fù)后，封閉并加抗體孵育，顯色、脫水、封片后，光學(xué)顯微鏡下讀片拍照，用BI-2000免疫組化分析軟件計算圖片平均灰度值，并進行分析統(tǒng)計(用平均灰度值來表示蛋白相對表達量，灰度值越大，蛋白表達量越低)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料以表示，采用單因素方差分析進行組間比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 歸芪益元膏對大鼠肺腎組織caspase-3、caspase-9 mRNA表達的影響 由表2可見，在右肺組織中，caspase-3、caspase-9 mRNA表達量在單純輻射6、12、24h后均明顯升高，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；CM 12h、24h組caspase-3 mRNA以及6h、24h組caspase-9 mRNA表達量均明顯低于同時間點的RO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其余時間點組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在左肺組織中，單純輻射6、12、24h后caspase-3、caspase-9 mRNA表達量均明顯升高，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；CM 24h組caspase-3 mRNA表達量明顯低于RO 24h組，CM 12h和24h組caspase-9 mRNA表達量明顯低于同時間點的RO組(P<0.01)，其余時間點組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在左腎組織中，caspase-3、caspase-9 mRNA表達量在單純輻射6、12、24h后均明顯升高，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；CM 12h、24h組caspase-3 mRNA表達量明顯低于同時間點的RO組，CM 6h、12h和24h組caspase-9 mRNA表達量均明顯低于同時間點的RO組(P<0.01)，其余時間點組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 歸芪益元膏對大鼠肺腎組織caspase-3和caspase-9 mRNA水平的影響(±s，n=6)Tab.2 Effects of Guiqiyiyuan Ointment on the levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in lung and kidney tissues of rats (±s, n=6)

表2 歸芪益元膏對大鼠肺腎組織caspase-3和caspase-9 mRNA水平的影響(±s，n=6)Tab.2 Effects of Guiqiyiyuan Ointment on the levels of caspase-3 and caspase-9 mRNA in lung and kidney tissues of rats (±s, n=6)

NC. Normal control; RO. Radiation only; CM. Chinese medicine; (1)P<0.01 compared with NC group; (2)P<0.01 compared with RO group

Group Right lung Left lung Left kidney Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 NC group 1.00± 0.02 1.00±0.05 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.03 RO group 6h 3.52±0.16(1) 10.46±0.35(1) 2.28±0.10(1) 7.31±0.29(1) 1.53±0.05(1) 5.05±0.15(1)12h 5.97±0.19(1) 13.28±0.48(1) 2.84±0.04(1) 6.24±0.23(1) 1.76±0.04(1) 5.21±0.19(1)24h 5.68±0.49(1) 13.90±0.43(1) 3.54±0.04(1) 9.54±0.21(1) 2.17±0.08(1) 6.50±0.12(1)CM group 6h 3.18±0.20 9.24±0.27(2) 2.43±0.03 6.95±0.29 1.30±0.04 4.00±0.06(2)12h 5.28±0.13(2) 12.27±0.22 2.57±0.06 5.33±0.22(2) 1.45±0.06(2) 4.85±0.08(2)24h 4.47±0.08(2) 11.54±0.60(2) 2.50±0.07(2) 4.52±0.30(2) 1.47±0.03(2) 4.84±0.13(2)

2.2 歸芪益元膏對大鼠肺腎組織caspase-3、caspase-9蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果顯示，caspase-3在正常肺組織中有少量表達，照射后24h在支氣管黏膜周圍表達增強，而在CM 24h組陽性表達減弱；正常腎組織中caspase-3幾乎無表達，照射后24h在腎小管中表達增強，而在CM 24h組陽性表達減弱(圖1A)。Caspase-9在正常肺組織中幾乎無表達，照射后24h在支氣管黏膜中表達明顯增強，而在CM 24h組陽性表達降低；正常腎組織中，caspase-9幾乎無表達，照射后24h在腎小管中表達增強，而在CM 24h組陽性表達降低(圖1B)。在右肺、左肺、左腎組織中，RO 24h組caspase-3蛋白表達量明顯升高，與NC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；CM 24h組caspase-3蛋白表達量明顯低于RO 24h組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其余時間點組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Caspase-9與caspase-3呈現(xiàn)相同的表達規(guī)律(表3)。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中雖無輻射及輻射旁效應(yīng)損傷的相關(guān)記載，但重離子束的高能、快速、穿透力強、殺傷力大等特性與中醫(yī)學(xué)“毒邪”的致病特點(如致病猛烈、發(fā)病急驟、傳變迅速、耗傷機體氣血陰津等)極為相似[9-11]，故輻射旁效應(yīng)損傷的中醫(yī)學(xué)病因為毒邪。毒邪直中臟腑、敗壞形體、耗傷機體氣血陰津，使機體氣血兩虛，陰津不足，氣虛無力推動血行，瘀血內(nèi)阻，故其病機以氣血兩虛、陰津不足為主，兼瘀血阻滯。

培元固本、益氣滋陰養(yǎng)血、整體調(diào)治為中醫(yī)藥防護輻射旁效應(yīng)損傷的基本原則，歸芪益元膏切合輻射旁效應(yīng)損傷的中醫(yī)病機。方中重用黃芪以補中益氣，壯后天之本，使元氣充實；配伍當(dāng)歸補氣以生血、養(yǎng)血活血；配伍人參大補元氣，生津養(yǎng)血；熟地補血滋陰，益精填髓；枸杞補腎滋陰；麥冬清熱生津，養(yǎng)陰潤肺；五味子益氣生津，滋補肺腎。諸藥合用共奏益氣滋陰、養(yǎng)血活血之效，使得“正氣存內(nèi)，邪不可干”，起到防護輻射損傷的作用。

Caspase家族蛋白酶在細胞凋亡中居中心地位，是多條凋亡通路的匯聚點，可以直接導(dǎo)致細胞凋亡解體，在凋亡中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[12]。其中caspase-9為凋亡起始因子，位于級聯(lián)反應(yīng)上游，能在其他蛋白參與下發(fā)生自我活化并激活下游的caspase-3；caspase-3是凋亡執(zhí)行因子，它的激活標志著細胞凋亡進入了不可逆轉(zhuǎn)的階段[13-14]。

圖1 各組大鼠肺腎組織中caspase-3和caspase-9蛋白表達比較Fig. 1 The protein expression levels of caspase-3 and caspase-9 in lung and kidney tissues of rats in each group

表3 歸芪益元膏對大鼠肺腎組織caspase-3和caspase-9蛋白表達的影響(±s，n=6)Tab.3 Effects of Guiqiyiyuan Ointment on the expressions of caspase-3 and caspase-9 in lung and kidney tissues of rats (±s, n=6)

表3 歸芪益元膏對大鼠肺腎組織caspase-3和caspase-9蛋白表達的影響(±s，n=6)Tab.3 Effects of Guiqiyiyuan Ointment on the expressions of caspase-3 and caspase-9 in lung and kidney tissues of rats (±s, n=6)

NC. Normal control; RO. Radiation only; CM. Chinese medicine; (1)P<0.01 compared with NC group; (2)P<0.01 compared with RO group

Group Right lung Left lung Left kidney Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 Caspase-3 Caspase-9 NC group 91.69±4.27 90.33±2.78 85.65±3.76 90.34±3.63 93.99±2.17 87.74±2.43 RO group 6h 84.94±2.41 88.13±3.36 80.24±4.44 86.82±4.29 88.66±1.90 81.82±3.59 12h 85.04±2.82 86.66±4.04 81.03±3.05 86.92±5.43 88.13±7.97 82.13±3.78 24h 81.35±2.89(1) 83.63±4.52(1) 76.44±5.22(1) 81.92±4.24(1) 84.06±3.95(1) 79.71±2.46(1)CM group 6h 87.13±4.75 88.43±1.68 83.33±2.81 87.80±5.68 90.61±2.50 85.42±3.63 12h 86.31±6.01 86.57±1.60 83.10±7.60 89.26±3.77 91.09±0.73 85.29±4.59 24h 91.86±4.61(2) 92.81±3.51(2) 87.80±2.52(2) 93.33±2.11(2) 95.30±2.20(2) 88.06±3.76(2)

本實驗結(jié)果顯示，2Gy12C6+離子照射大鼠右肺部后，右肺、左肺、左腎中caspase-3、caspase-9 mRNA表達在照射后6、12、24h均明顯升高，蛋白表達在照射后24h明顯升高。該結(jié)果表明未直接照射的左肺和左腎出現(xiàn)了與直接照射組織右肺類似的凋亡基因異常表達現(xiàn)象，未受照射組織也對輻射產(chǎn)生了響應(yīng)，輻射誘導(dǎo)了體內(nèi)旁效應(yīng)的產(chǎn)生。預(yù)先灌胃歸芪益元膏后，大鼠右肺、左肺、左腎中caspase-3、caspase-9 mRNA及蛋白表達較同時間點的RO組下調(diào)，表明預(yù)先灌胃歸芪益元膏可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)caspase-3、caspase-9 mRNA及蛋白表達量的升高，提示歸芪益元膏可以通過抑制caspase級聯(lián)反應(yīng)起到保護肺腎細胞、減緩肺腎細胞凋亡的作用。

綜上所述，重離子輻射大鼠右肺部后，左、右肺和左腎組織中存在caspase-3、caspase-9基因表達的異常，歸芪益元膏可通過抑制caspase-9、caspase-3表達的上調(diào)減輕肺腎細胞凋亡，從而發(fā)揮其對重離子輻射誘發(fā)體內(nèi)旁效應(yīng)損傷的防護作用。

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