董德嘉 李勝龍 王夫景

結(jié)腸癌是消化道常見腫瘤，在我國及世界范圍內(nèi)其發(fā)病率與病死率呈逐年升高趨勢[1]。手術(shù)及化療是結(jié)腸癌治療的主要手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)與化療耐藥大大降低了治療效果，因此迫切需要尋找新的治療藥物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對多種腫瘤具有預(yù)防與治療作用[2-3]，并能通過激活A(yù)MPK從而誘導(dǎo)自噬(autophagy)發(fā)生[4-5]。自噬是當細胞自穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變或機體受外界的各種刺激的情況下，細胞借此回收或清除胞內(nèi)多余或損傷的細胞器及胞內(nèi)成分的一個過程[6]。自噬對腫瘤的作用可謂是一把“雙刃劍”，低水平的自噬能促進腫瘤細胞生存，但過量的自噬極有可能導(dǎo)致細胞死亡[7]。本實驗以體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細胞株SW480為模型，探討AMPK在二甲雙胍誘導(dǎo)SW480細胞自噬中的作用，以了解二甲雙胍潛在的抗腫瘤機制。

材料與方法

一、材料與試劑

人結(jié)腸癌細胞株SW480購于中國科學院細胞庫，于-80 ℃凍存；二甲雙胍、雷帕霉素(RAPA)、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)購買于Sigma公司；p-AMPK、AMPK、LC3、p62抗體購于Cell Signal Technology公司，β-actin抗體購自Santa Cruz公司；細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司；PVDF膜、ECL顯影液和HRP標記山羊抗兔IgG購于Millpore公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green I染料、Lipofectamine 200轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；其余化學試劑均為分析純。

二、方法

1.細胞培養(yǎng) SW480細胞株培養(yǎng)于含37 ℃、5%CO2、10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，隔天傳代1次。

2.Western blot檢測蛋白表達 收集細胞于Eppendorf管中，棄掉上清液并將細胞懸浮于裂解液中，超聲破碎細胞，冰上裂解30 min后，4 ℃, 15 000 r/min離心10 min，取上清，采用BCA法測定上清液中蛋白質(zhì)含量，并取等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，低溫轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉，分別加入相應(yīng)一抗和二抗，經(jīng)增強化學發(fā)光法(ECL)系統(tǒng)顯色，用數(shù)字成像儀對圖像進行拍照和分析。

3.實時熒光定量PCR檢測mRNA表達 用Trizol法提取細胞總RNA，反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進行實時熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 10 min，1個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)，樣本中目的基因表達的計算方法為2-ΔΔCt[8]。各基因引物序列見表1。

4.RNA瞬時干擾AMPK的siRNA序列 (5'-CGU UAC CUA GCA UCA AUU Gtt-3')和陰性干擾RNA 鏈購于ambion公司。當細胞密度達40%～50%時，將siAMPK和陰性干擾RNA 鏈各100 pmol置于250 μl Opti-MEM(r) I Reduced Serum Medium培養(yǎng)液中。同時將兩份各5μl的lipofectamine 2000置于250 μl Opti-MEM(r) I Reduced Serum Medium培養(yǎng)液中。把上述含siRNA 的培養(yǎng)液與含lipofectamine 2000的培養(yǎng)液二者混合，加入細胞中。孵育6 h后改換10% RPMI-1640的常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列和產(chǎn)物大小

三、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、二甲雙胍對SW480細胞AMPK活性影響

不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理SW480細胞24 h，并設(shè)置陰性對照組。采用Western blot法檢測AMPK及其磷酸化蛋白表達情況，見圖1。與陰性對照組相比，隨著二甲雙胍劑量的增加，AMPK總蛋白水平未見明顯變化，但磷酸化水平逐漸增加。結(jié)果表明二甲雙胍可以誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細胞AMPK的活化。

圖1 不同劑量二甲雙胍作用人結(jié)腸癌SW480細胞后p-AMPK、AMPK表達情況及灰度值分析

二、二甲雙胍對SW480細胞自噬相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)基因表達的影響

不同濃度(1、5、10 mmol/L)二甲雙胍處理SW480細胞24 h，并設(shè)置陰性對照組、雷帕霉素陽性對照組，采用Western blot法檢測自噬標志蛋白LC3和p62的表達情況，見圖2A；熒光定量PCR技術(shù)檢測LC3 mRNA表達，見圖2B。二甲雙胍處理前2 h用5 mmol/L的3-MA抑制自噬，再用10 mmol/L二甲雙胍處理24 h，實驗分為陰性對照、3-MA、二甲雙胍、二甲雙胍+3-MA共4組，Western blot檢測自噬標志蛋白LC3和p62的表達情況，見圖2C。結(jié)果表明，隨著二甲雙胍劑量的增加，自噬標志蛋白LC3表達逐漸增加，p62表達逐漸降低。而3-MA可明顯抑制二甲雙胍的作用。以上結(jié)果表明二甲雙胍能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細胞發(fā)生自噬。

三、沉默AMPK對二甲雙胍誘導(dǎo)SW480細胞自噬的影響

二甲雙胍處理前用siRNA沉默AMPK后，用10 mmol/L的二甲雙胍處理細胞24 h，實驗分為陰性對照、siRNA、Met、Met+siRNA 4組。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比二甲雙胍明顯活化AMPK，自噬相關(guān)蛋白LC3表達也顯著增加，p62表達則明顯降低，LC3mRNA表達增高。Met+siRNA組AMPK活性明顯降低，LC3表達下降，而p62表達升高，LC3 mRNA表達降低。以上結(jié)果表明，沉默AMPK后，二甲雙胍誘導(dǎo)的SW480細胞自噬水平明顯下降。

A.不同劑量二甲雙胍處理SW480細胞后自噬相關(guān)蛋白LC3與p62表達情況及灰度值分析;B.二甲雙胍與自噬抑制劑3-MA單獨或聯(lián)合應(yīng)用對自噬相關(guān)蛋白LC3與p62的影響及灰度值分析;C.不同劑量二甲雙胍處理SW480細胞后自噬相關(guān)基因LC3表達情況;*P<0.05,#P<0.05;Met.二甲雙胍圖2 二甲雙胍對SW480細胞自噬相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)基因表達的影響

A.沉默AMPK后二甲雙胍對SW480細胞LC3、p62表達影響及灰度值分析;B.沉默AMPK后二甲雙胍對SW480細胞LC3mRNA表達影響;*P<0.05,#P<0.05;Met.二甲雙胍圖3 沉默AMPK對二甲雙胍處理后SW480細胞自噬的影響

討 論

二甲雙胍是臨床上廣泛應(yīng)用的一種口服降糖藥，具有改善胰島素抵抗，減輕體重，改善脂代謝，抗氧化等特點，近年來研究發(fā)現(xiàn)其還具有預(yù)防和治療腫瘤的作用。AMPK即腺苷酸活化蛋白激酶，是機體內(nèi)的能量感受器，在能量代謝、細胞凋亡與自噬調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。缺氧、能量缺乏等應(yīng)激條件下，細胞內(nèi)AMP與ATP比值升高可激活A(yù)MPK。Zakikhani等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可能通過AMPK信號通路起到抑制腫瘤的作用。體外細胞試驗及動物學試驗研究同樣表明二甲雙胍能通過激活A(yù)MPK抑制mTOR信號通路從而抑制腫瘤的生長[11]。本研究采用不同濃度二甲雙胍作用于SW480細胞24 h后檢測AMPK及其磷酸化蛋白表達情況，結(jié)果表明隨著二甲雙胍濃度增加，AMPK活性逐漸增加。結(jié)果表明，二甲雙胍可以誘導(dǎo)SW480細胞中AMPK的活化。

自噬是細胞降解自身細胞器、無用生物大分子的特定生物學過程，從而滿足細胞自身的代謝需要和應(yīng)對特定的應(yīng)激狀態(tài)[12]。自噬雖能一定程度幫助細胞應(yīng)對各種應(yīng)激條件，但過度激活自噬也會導(dǎo)致細胞死亡，這一過程被稱作是Ⅱ型程序性細胞死亡[13]。自噬發(fā)生時，胞質(zhì)型LC3即LC3-Ⅰ會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型即LC3-Ⅱ，因此，LC3-Ⅱ的水平可估計自噬水平的高低。此外，p62作為被自噬特異性降解的一種蛋白質(zhì)，其表達水平一定程度上也反映了自噬的水平[14]。本研究結(jié)果顯示，SW480細胞內(nèi)LC3-Ⅱ蛋白表達水平以及其mRNA水平均隨著二甲雙胍作用濃度的增加而增高，而p62蛋白水平隨著二甲雙胍濃度的增加表達減少，以上結(jié)果表明二甲雙胍能夠誘導(dǎo)SW480細胞發(fā)生自噬。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK在自噬中起到關(guān)鍵作用。AMPK不僅能通過mTOR、p53調(diào)控自噬，還可通過直接磷酸化ULK1誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。Hung等[15]的研究發(fā)現(xiàn)AMPK在肝癌細胞發(fā)生自噬中起到關(guān)鍵作用，AMPK活化后引起TSC1/2的活性升高，從而抑制GTP 聯(lián)合蛋白Ras，進一步抑制mTOR的生物學功能，誘導(dǎo)自噬發(fā)生[16]。本研究采用RNAi技術(shù)沉默SW480細胞中AMPK表達，探討AMPK在自噬中的作用。結(jié)果顯示，AMPK沉默后，二甲雙胍誘導(dǎo)的LC3表達明顯下調(diào)，LC3的mRNA表達也明顯下降，p62的表達則顯著增加。該結(jié)果表明，AMPK在二甲雙胍誘導(dǎo)SW480細胞自噬中發(fā)揮重要作用。

以上結(jié)果表明，二甲雙胍誘導(dǎo)了SW480細胞中AMPK的活化，并且AMPK在二甲雙胍誘導(dǎo)的細胞自噬中起到關(guān)鍵作用。本研究進一步闡明了二甲雙胍抑制腫瘤細胞的分子機制，在對于結(jié)腸癌的術(shù)后化療及輔助化療有指導(dǎo)意義，可在臨床工作中的術(shù)后化療及輔助化療中加用二甲雙胍。協(xié)同抗腫瘤藥物使用。后續(xù)工作需建立動物模型，研究二甲雙胍是否影響動物腫瘤細胞中AMPK活性。

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