蔡遜 王世杰 馬丹丹 張智勇

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，目前其在我國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌死亡的主要原因[3-5]，其中肝臟轉(zhuǎn)移是最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。因此，如能阻斷結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移途徑，則能大大提高結(jié)腸癌病人的生存率。近年來，趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中的作用受到廣泛關(guān)注[7-8]。研究表明：趨化因子受體7(chemokine receptor 7，CCR7)是7次跨膜受體G蛋白偶聯(lián)受體，在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、播散及腫瘤血管形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]。本研究旨在采用免疫組織化學(xué)、Real-time PCR及Western blot等技術(shù)檢測(cè)CCR7在90例結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況，探討其表達(dá)水平與與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的相關(guān)性。以期為尋找結(jié)腸癌新的治療靶點(diǎn)提供有力依據(jù)。

資料與方法

一、資料及試劑

1.一般資料 選取我院2015年1月至12月的90例人結(jié)腸癌組織及其配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)，且術(shù)前未行化療或放療。癌旁組織標(biāo)本取自至少距腫瘤邊緣5cm處，新鮮標(biāo)本離體后立即置入液氮中保存。所有標(biāo)本的獲取均征得病人本人及家屬同意，并通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2.主要試劑 兔抗人CCR7單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗均購(gòu)自Abcam公司。Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，總蛋白抽提試劑盒、RNA提取試劑盒購(gòu)自Tiangen公司。免疫組織化學(xué)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購(gòu)自武漢博士德生物公司。CCR7引物序列為：上游引物是5′-AGGCTATTGTCCCCTAAACC-3′及下游引物是5′-GGAGGACAGTGAAGAAAACG-3′；β-actin引物序列為：上游引物是5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′及下游引物是5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。均由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)公司設(shè)計(jì)并合成。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色按試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作，常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，微波抗原修復(fù)，兔抗人CCR7單克隆抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片固定。用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作陰性對(duì)照，相同條件下每個(gè)樣本重復(fù)3次。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CCR7表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)定和分析。未見陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞率<5%判定為陰性(-)，陽性細(xì)胞率5%～25%定為弱陽性(+)，25%～50%為中度陽性(++)，>50%為強(qiáng)陽性(+++)。

2. Real-time PCR檢測(cè)CCR7 mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑盒提取90例結(jié)腸癌組織及配對(duì)癌旁組織的總mRNA，以紫外分光光度儀檢測(cè)其吸光度值(A260 nm/A280 nm值為1.8～2.0為理想值)，計(jì)算其濃度以便指導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄模板的需要量。接著用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-80℃冰箱備用。所有操作步驟均按照說明書進(jìn)行。Real-time PCR總反應(yīng)體系為20 μl：2×SYBR Green mix緩沖液10 μl，10 μmol/L的上下游引物各0.6 μl，cDNA 2 μl，DEPC水6.8 μl。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。每個(gè)樣本均做3個(gè)復(fù)孔，并重復(fù)3次。各組中CCR7的相對(duì)表達(dá)量通過2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

3.Western blot檢測(cè)CCR7蛋白表達(dá) 分別稱取0.1 g結(jié)腸癌組織和癌旁組織，加800 μl全蛋白提取液(放射免疫沉淀裂解液，RIPA)，含10%蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)提取蛋白。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。各組150 μg上樣于5.0%濃縮膠，15%分離膠，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白于PVDF膜，加5%脫脂奶粉稀釋的一抗CCR7及β-actin(1∶500稀釋)封閉，4 ℃過夜，加HRP標(biāo)記二抗(1∶5000稀釋)，37 ℃條件溫育2 h，化學(xué)發(fā)光法顯影檢測(cè)。免疫印跡條帶的灰度值經(jīng)灰度掃描儀分析后獲得。CCR7相對(duì)表達(dá)水平通過與內(nèi)參比較確定。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

在90例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中CCR7主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，詳見圖1。在癌旁組織中，細(xì)胞質(zhì)著色多為淡黃色，CCR7為陰性，弱陽性或中度陽性，然而，在結(jié)腸癌組織中，細(xì)胞質(zhì)染色較深，以棕黃色和棕黑色為主，CCR7弱陽性、中度陽性或強(qiáng)陽性。中度陽性及強(qiáng)陽性均判定為陽性表達(dá)。組織學(xué)評(píng)分后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CCR7蛋白在癌旁組織與結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為36%(32/90)和77%(69/90)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.689，P=0.000)。15例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CCR7著色深，有棕黃色顆粒，染色強(qiáng)度均為強(qiáng)陽性。45例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中62%(28/45)染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽性，38%(17/45)染色強(qiáng)度為中度陽性。

A.無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;B.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;C.遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組圖1 CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)

二、CCR7在結(jié)腸癌中的基因表達(dá)

在90例結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中均可檢測(cè)到CCR7基因的表達(dá)，且CCR7 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(1.59±0.27比0.57±0.08，t=34.828，P=0.000)，見圖2。

*P<0.05圖2 CCR7基因在結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)

三、CCR7在結(jié)腸癌中的蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織中均有表達(dá)，在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，且CCR7蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。見圖3。

四、CCR7蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系

CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)量以結(jié)腸癌組織CCR7條帶的灰度值與對(duì)應(yīng)的β-actin的灰度值之比來表示。通過統(tǒng)計(jì)分析顯示：CCR7蛋白表達(dá)量與結(jié)腸癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無明顯相關(guān)(P>0.05)。詳見表1。

N:癌旁組織;T:結(jié)腸癌組織①無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;②淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;③遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移圖3 CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)

表1 CCR7蛋白表達(dá)量與90例結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系±s)

討 論

趨化因子是指能使細(xì)胞發(fā)生趨化運(yùn)動(dòng)的分泌型小分子蛋白質(zhì)(相對(duì)分子質(zhì)量為8000～11000)，趨化因子受體是能夠特異性結(jié)合趨化因子的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體[11-12]。CCR7為CC類趨化因子受體之一，越來越多的證據(jù)[13-17 ]顯示，CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌等腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而，對(duì)于CCR7在結(jié)腸癌生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用研究甚少。

在腫瘤組織及其相應(yīng)鄰近正常組織的差異性表達(dá)是分析基因與腫瘤關(guān)系的基礎(chǔ)，異常表達(dá)的基因可能在腫瘤的形成中扮演重要角色，可認(rèn)為是潛在的新一類控制細(xì)胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[18]。本研究中，筆者選取90例結(jié)腸癌病人的腫瘤組織及相應(yīng)配對(duì)的癌旁組織，分別采用Real-timePCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)CCR7mRNA和蛋白表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果表明CCR7在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)癌旁組織。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示CCR7在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，在癌旁組織中，細(xì)胞質(zhì)著色多為淡黃色，CCR7為陰性，弱陽性或中度陽性，然而，在結(jié)腸癌組織中，細(xì)胞質(zhì)染色較深，以棕黃色和棕黑色為主，CCR7弱陽性、中度陽性或強(qiáng)陽性。進(jìn)一步證實(shí)CCR7蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)同樣顯著高于癌旁組織。有研究[13-17]稱CCR7在多種腫瘤中過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞定向遷移。本研究結(jié)果證實(shí)：CCR7在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中具有癌基因特性，促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

本實(shí)驗(yàn)采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)CCR7在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達(dá)量并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，通過統(tǒng)計(jì)分析得出：CCR7蛋白表達(dá)量與結(jié)腸癌浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)，然而與性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無明顯相關(guān)性。Correale等[19]研究得出，CCR7在結(jié)腸癌中的表達(dá)與病人性別、年齡、腫瘤分型、分期無關(guān)，但在直腸癌中的表達(dá)與腫瘤分化、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果與其基本一致。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)對(duì)90例結(jié)腸癌組織及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CCR7主要表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞膜或(和)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。組織學(xué)評(píng)分后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CCR7蛋白在癌旁組織與結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為36%(32/90)和77%(69/90)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Malietzis等[20]的報(bào)道相符。本研究中，15例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中，CCR7著色深，有棕黃色顆粒，染色強(qiáng)度均為強(qiáng)陽性。45例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中62%(28/45)染色強(qiáng)度為強(qiáng)陽性，38%(17/45)染色強(qiáng)度為中度陽性。有研究[21]表明,約80%的結(jié)腸癌組織表達(dá)CCR7,且多因素回歸分析得出，CCR7高表達(dá)是與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的最重要因素。本研究結(jié)果與這一結(jié)論相符。檢測(cè)結(jié)腸癌組織CCR7表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較高的判斷價(jià)值。另外，術(shù)前對(duì)鏡檢標(biāo)本或前哨淋巴結(jié)標(biāo)本進(jìn)行CCR7檢測(cè)，不僅可預(yù)測(cè)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且對(duì)手術(shù)方案的選擇及術(shù)后進(jìn)一步的靶向治療均具有重要價(jià)值。

綜上所述，CCR7在結(jié)腸癌組織中存在過度表達(dá)，參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程，促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移，這可能是結(jié)腸癌發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一。阻斷CCR7的表達(dá)可能為結(jié)腸癌的治療提供新思路。

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