王雅娟，馬清萍，于洋，宋春磊，程逸飛，史珺怡，林志芬,*

1. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室, 上海 200092 2. 上海市化學(xué)品分析、風(fēng)險評估與控制重點實驗室, 上海 200092 3. 上海污染控制與生態(tài)安全研究院, 上海 200092 4. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院, 上海 2013062 5. 環(huán)境保護(hù)部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心, 北京 100029 6. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 桂林 541004

抗生素具有強(qiáng)大的抗菌能力，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、禽畜業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)均被大量投入使用，2013年我國抗生素的年使用量達(dá)16.2萬噸[1]。但是，隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，細(xì)菌耐藥性問題受到了越來越多的關(guān)注。細(xì)菌耐藥性形成和傳播的重要條件之一是抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)的獲得[2-3]，主要有2種方式：一是在長期的抗生素選擇壓力下細(xì)菌自身發(fā)生基因突變，從而產(chǎn)生抗藥性，雖然基因自發(fā)突變率只有10-8～10-6[4]，但是微生物增殖快、體積小、分布廣的特性放大了細(xì)菌基因突變的作用；二是細(xì)菌通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得外源性抗性基因，耐藥基因水平轉(zhuǎn)移是指基因跨越細(xì)菌間的種屬屏障，在種內(nèi)不同個體之間、種間甚至是屬間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，是細(xì)菌在開放的環(huán)境中獲得抗性基因的重要途徑[3]，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合轉(zhuǎn)移3種方式[5]。其中，接合轉(zhuǎn)移是環(huán)境中基因水平轉(zhuǎn)移最普遍、最有效的1種方式，是以質(zhì)粒作為抗性基因載體，通過細(xì)胞之間的接觸發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移的抗性基因傳播方式[6-7]。細(xì)菌耐藥性將會給許多疾病的預(yù)防和控制增加難度并對人類健康產(chǎn)生威脅，其產(chǎn)生和傳播規(guī)律是亟待明確的問題。

為了解決細(xì)菌耐藥性問題，許多研究圍繞抗性基因展開，發(fā)現(xiàn)其形成與傳播跟群體感應(yīng)(quorum sensing, QS)相關(guān)。群體感應(yīng)系統(tǒng)是一種全局性的調(diào)控系統(tǒng)，參與調(diào)控多種細(xì)菌的多項生命活動，密度依賴型的生命活動多與該系統(tǒng)有關(guān)。Kra?ovec等[8]研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌(Escherichia coli )能夠通過AI-2種間群體感應(yīng)系統(tǒng)改變利福平耐藥突變率；Qiu等[9]和Chatterjee等[10]研究發(fā)現(xiàn)，菌體密度越高，越有利于接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，基于群體感應(yīng)系統(tǒng)對基因突變、接合轉(zhuǎn)移的影響研究可能是未來探究細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和傳播規(guī)律的一個新思路。

磺胺類抗生素(SAs)因其價格低、抗菌譜廣、易儲存等優(yōu)點被廣泛使用。有關(guān)SAs的生物毒性研究大多圍繞單一及聯(lián)合毒性展開，關(guān)于其對生長、基因突變和接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)與群體感應(yīng)系統(tǒng)之間的聯(lián)系的研究尚少。有研究表明，角蒽環(huán)抗生素能夠作為種間信號分子通過群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)天藍(lán)色鏈霉菌的一系列生理行為[11]。那么，群體感應(yīng)信號分子是否會影響SAs對大腸桿菌的生長、突變和接合轉(zhuǎn)移？

本文選取大腸桿菌為模式生物，探究了群體感應(yīng)信號分子N-(β-酮己酰)-L-高絲氨酸內(nèi)酯(3-oxo-C6-HSL, C6)與SAs對大腸桿菌的聯(lián)合毒性效應(yīng)、突變效應(yīng)和接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)。該研究有助于更準(zhǔn)確全面的認(rèn)識SAs對大腸桿菌的生長效應(yīng)、突變效應(yīng)、接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)與種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系，為探究大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生與傳播提供新思路。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　試劑與儀器

實驗中的大腸桿菌 MG1655菌株購買于北京譜如汀生物技術(shù)有限公司，IncW抗性質(zhì)粒R388購于普如汀生物技術(shù)有限公司。C6購于cayman化合制品有限公司(USA)，其他化合物均購于Sigma-Aldrich 化學(xué)制品有限公司(上海)，純度均≥99%，試劑信息見表1。

1.2　工作菌液的制備

將R388質(zhì)粒供體菌和有萘啶酮酸抗性標(biāo)記的受體菌分別接種于含有25 mg·L-1卡那霉素和25 mg·L-1萘啶酮酸的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床中以180 r·min-1的轉(zhuǎn)速震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(6 h)，將培養(yǎng)的菌液離心去上清液后加入1% NaCl至原體積，震蕩重新懸浮。用1% NaCl溶液調(diào)節(jié)菌液OD600為0.5，再將受體菌和R388供體菌以10：1的比例混勻即為工作菌液。

1.3　暴露實驗

采用微量肉湯稀釋法對受試抗生素進(jìn)行暴露實驗，37 ℃、180 r·min-1的條件下培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期。

生長量測定：使用全波長酶標(biāo)儀(Multiskan GO，美國賽默飛世爾科技公司)測得OD600用于表征細(xì)菌生長量。

突變子數(shù)測定：使用40 mg·L-1利福平篩選平板篩選穩(wěn)定期突變菌，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h后對菌落計數(shù)。

受體菌和接合子的測定：暴露結(jié)束后，對體系進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用含抗生素的篩選平板篩選抗性菌，其中，受體菌的篩選平板含40 mg·L-1萘啶酮酸，R388接合子的篩選平板含40 mg·L-1萘啶酮酸、40 mg·L-1甲氧芐啶和40 mg·L-1磺胺甲惡唑。將篩選平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后對菌落計數(shù)。

1.4　數(shù)據(jù)表征

MM法(MSS maximum likelihood)用于計算突變率時，不僅計算結(jié)果重復(fù)性較好，而且可直接估算突變率，適用于傳統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)[12-14]。本文選擇MM法，將不同濃度受試化合物染毒下對應(yīng)的突變子數(shù)換算為突變次數(shù)?；衔飳Υ竽c桿菌的生長效應(yīng)和突變效應(yīng)均用促進(jìn)率表示，計算如公式(1)所示：

(1)

式中，P 表示生長量促進(jìn)率或突變促進(jìn)率，f0、fi分別表示對照組、第i個測試樣的OD600值或突變次數(shù)。

化合物對大腸桿菌的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移效應(yīng)用抑制率表示，計算如公式(2)所示：

(2)

式中，P 表示接合轉(zhuǎn)移抑制率，f0、 fi分別表示對照組、第i個測試樣的接合子數(shù)。

表1　受試化合物基本信息Table 1　 Information of reagents used in the experiment

本文使用Weibull函數(shù)[15]和biphasic函數(shù)[16]進(jìn)行曲線擬合并作圖，如公式(3)和(4)所示。

Pc= pmax-(pmax-p0)× exp (-(m×c )n)

(3)

式中，pmax、p0、m 及n 分別為擬合參數(shù)，其中pmax表征劑量效應(yīng)曲線最高劑量的抑制率pc；p0表示濃度c 為0時的抑制率pc，本實驗中設(shè)置為0。

(4)

式中，因pmin1和pmin2在本文已知，故將其分別設(shè)置為常數(shù)0和-100，pmax、c1、c2、h1、h2均作為參數(shù)參與擬合。

2　結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1　C6存在下SCP對大腸桿菌生長的影響

本文測定了不同濃度的C6存在下SCP對大腸桿菌生長的影響，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，SCP作用于大腸桿菌時，對細(xì)菌生長有抑制作用，且劑量-效應(yīng)曲線呈經(jīng)典S型，EC50為2.63E-6 mol·L-1。為了探究群體感應(yīng)信號分子是否影響SCP對大腸桿菌的毒性，本文在梯度濃度SCP的基礎(chǔ)上分別加入等濃度的C6，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCP分別與2 μmol·L-1、20 μmol·L-1、200 μmol·L-1、2 000 μmol·L-1的C6 聯(lián)合作用時的EC50分別為：2.03E-6 mol·L-1、2.91E-6 mol·L-1、3.92E-6 mol·L-1、2.73E-6 mol·L-1，可見，C6不影響SCP對大腸桿菌的毒性效應(yīng)。研究表明，群體感應(yīng)系統(tǒng)可以調(diào)控細(xì)菌毒力因子的表達(dá)、固氮基因、Ti質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移、抗生素的產(chǎn)生、細(xì)菌群游與生物被膜的形成、生物發(fā)光等，不影響細(xì)菌的生長繁殖[17]。所以，本文推測SAs對大腸桿菌的生長毒性與群體感應(yīng)系統(tǒng)無關(guān)。那么，群體感應(yīng)系統(tǒng)是否會影響基因突變和接合轉(zhuǎn)移?

2.2　C6存在下SAs對大腸桿菌突變的影響

有文獻(xiàn)指出1 μmol·L-1和25 μmol·L-1的C6能夠調(diào)節(jié)費氏弧菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)[18]，實際檢測發(fā)現(xiàn)菌落中的群體感應(yīng)信號分子的濃度大多不超過40 μmol·L-1[19]。因此，本文選擇20 μmol·L-1的C6，測定了其存在下SCP對大腸桿菌突變的影響，此外，本文以SMX、SPY為研究對象對所得結(jié)果加以驗證，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，3種SAs對大腸桿菌突變率均有顯著的促進(jìn)作用，效應(yīng)曲線呈倒U型，單一作用時SCP、SMX、SPY的最大促進(jìn)率分別為196.30%、100.88%、117.01%。有文章指出，真空干燥引起的應(yīng)激反應(yīng)(SOS反應(yīng))是離子注入的真空干燥條件誘發(fā)大腸桿菌突變的主要原因之一[20]，并且SOS反應(yīng)能夠被環(huán)丙沙星、利福平、β-內(nèi)酰胺、甲氧芐胺嘧啶等抗生素激活[21]。本文猜測，SAs也能夠通過引起SOS反應(yīng)而導(dǎo)致大腸桿菌突變，而藥物濃度增大會引發(fā)更為劇烈的SOS反應(yīng)，細(xì)菌發(fā)生SOS反應(yīng)時出現(xiàn)錯誤修復(fù)的次數(shù)增多，基因突變率隨之增大。

C6與SAs聯(lián)合作用對大腸桿菌突變率同樣有顯著的促進(jìn)效應(yīng)，相比SAs單一作用時促進(jìn)作用較小，與C6聯(lián)合作用時SCP、SMX、SPY的最大促進(jìn)率分別為155.35%、64.76%、89.93%。這說明C6能夠削弱SAs對大腸桿菌突變的促進(jìn)作用。有研究表明群體感應(yīng)能夠調(diào)控細(xì)菌外排泵基因的表達(dá)[22-23]， Rahmati等[24]發(fā)現(xiàn)SdiA蛋白能夠正向調(diào)控大腸桿菌多藥外排泵AcrAB-TolC系統(tǒng)中AcrAB蛋白的表達(dá)，而大腸桿菌的SdiA蛋白屬于LuxR家族，C6與SdiA蛋白結(jié)合可能進(jìn)一步激活群體感應(yīng)系統(tǒng)，增強(qiáng)大腸桿菌外排泵基因的表達(dá)，大腸桿菌將SAs泵出(如圖3所示)，從而削弱SAs引起的SOS反應(yīng)，降低SAs對大腸桿菌的突變促進(jìn)作用。

圖1　不同濃度N-(β-酮己酰)-L-高絲氨酸內(nèi)酯(C6)存在下SCP對大腸桿菌生長的影響Fig. 1　Effect of SCP on growth of Escherichia coli in the presence of 3-oxo-C6-HSL (C6) with different concentrations

2.3　C6存在下SAs對大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移的影響

為了進(jìn)一步探究群體感應(yīng)信號分子對抗生素抗性基因傳播的影響，本文測定了20 μmol·L-1C6存在下SCP對R388質(zhì)粒在大腸桿菌種屬內(nèi)接合轉(zhuǎn)移的影響，此外，本文以SMX、SPY為研究對象對所得結(jié)果加以驗證，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，3種SAs對大腸桿菌R388質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移均有顯著的抑制作用，效應(yīng)曲線呈S型，單一作用時SCP、SMX、SPY的20%促進(jìn)率對應(yīng)的濃度分別為3.48E-6 mol·L-1、7.05E-6 mol·L-1、8.76E-5 mol·L-1。接合轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的生理過程，其發(fā)生的必要條件是供體菌與受體菌之間的物理接觸，而低濃度抗生素會削弱鞭毛介導(dǎo)的泳動能力[25]，所以推測SAs能夠降低大腸桿菌的泳動能力，導(dǎo)致細(xì)胞相互接觸的幾率減少，從而抑制接合轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

圖2　C6存在下SAs對大腸桿菌突變率的影響Fig. 2　Effect of sulfonamides on mutation ratio of Escherichia coli in the presence of C6

圖3　C6與SdiA蛋白作用模式示意圖Fig. 3　The schematic of the mode of action between C6 and SdiA

圖4　C6存在下SAs對R388質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響Fig. 4　Effect of sulfonamides on conjugal transfer of plasmid R388 of Escherichia coli in the presence of C6

C6與SAs聯(lián)合作用對大腸桿菌R388質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移同樣有顯著的抑制效應(yīng)，且比SAs單一作用時的抑制作用大，與C6聯(lián)合作用時SCP、SMX、SPY的20%促進(jìn)率對應(yīng)的濃度分別為2.52E-6 mol·L-1、1.10E-5 mol·L-1、2.13E-5 mol·L-1。可見C6能夠增強(qiáng)SAs對大腸桿菌R388質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的抑制作用。接合轉(zhuǎn)移需要一系列酶的參與：DNA在解旋酶的切割作用下產(chǎn)生缺口并復(fù)制一條單鏈DNA，該單鏈DNA通過“接合橋”進(jìn)入受體菌內(nèi)[26]，受體菌的限制修飾系統(tǒng)能夠識別并降解外源DNA，如果進(jìn)入受體菌內(nèi)的單鏈DNA未被識別降解，就會形成完整的環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒，則接合轉(zhuǎn)移成功。本文猜測C6對大腸桿菌R388質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的影響可能是通過參與調(diào)控限制修飾系統(tǒng)，使得轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的單鏈DNA容易被識別降解，無法形成完整的環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒，從而降低質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率。

綜上可知：

1)C6不影響SAs對大腸桿菌的毒性效應(yīng)，推測SAs對大腸桿菌的生長毒性與群體感應(yīng)系統(tǒng)無關(guān)。

2)C6能夠削弱SAs對大腸桿菌突變的促進(jìn)作用，推測群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠通過調(diào)控外排泵基因的表達(dá)，將SAs泵出細(xì)菌外以削弱SAs引起的應(yīng)激反應(yīng)，從而降低突變促進(jìn)作用。

3)C6能夠增強(qiáng)SAs對大腸桿菌R388質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的抑制作用，推測群體感應(yīng)系統(tǒng)可能是通過參與調(diào)控限制修飾系統(tǒng)發(fā)揮作用。

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