丁婷婷，董欣琪，張瑾,2,，班龍科，王磊

1. 安徽建筑大學環(huán)境與能源工程學院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601 2. 清華大學新興有機污染物控制北京市重點實驗室，北京 100084

沒有一種污染物是單獨存在的，而是以各種形式和濃度共存于環(huán)境中的，進而形成了各種各樣復雜的混合污染物?；旌衔廴疚锏穆?lián)合毒性與相互作用對環(huán)境中的生物生存構成了潛在的威脅[1-2]。因此，混合污染物的聯(lián)合毒性評估是一個挑戰(zhàn)性與必要性并存的課題[3]，而合理的試驗設計是有效評估聯(lián)合毒性的首要條件[4-5]。環(huán)境毒理學研究中，學者們常用的混合物設計方法主要有析因設計(FD)[6]、固定濃度比射線法(FCRR)[7]和直接均分射線設計法(EquRay)[8]等。其中FD是研究簡單混合物毒性的經典方法，因其實驗工作量隨組分和濃度水平數(shù)呈指數(shù)增加，而不適于多元混合物毒性的研究。FCRR法是將傳統(tǒng)單點毒性評價方法轉變?yōu)檎麄€濃度-效應曲線(CRC)上評價的設計方法，且適于3個以上組分混合物的設計。然而，F(xiàn)CRR法只選擇了一種近似真實的濃度配比，不能全面反映真實環(huán)境中混合物的濃度分布。EquRay法是在FCRR法的基礎上建立的二元混合物的設計方法，但不適于組分在整個空間濃度配比的多元混合物毒性評估。均勻設計射線法(uniform design ray, UD-Ray)[9]是成功地將FCRR法與均勻設計(uniform design, UD)結合的混合物設計方法，該方法能以盡可能少的工作量有效地探索混合物尤其多元混合物在不同組分濃度空間配比的毒性變化情況[9]。

除了合理的實驗設計，合適的聯(lián)合毒性評估方法也很重要。目前，關于聯(lián)合作用評估的經典方法主要有等效線圖法(Isobolograms)[10]、毒性單位法(TU)[11]、加和指數(shù)法(AI)[12]和混合物毒性指數(shù)法(MTI)[13]等。但這些指數(shù)方法只研究了混合物體系在某一個特殊效應濃度(通常為50%效應時的濃度)的毒性作用情況，不能表征整個混合物體系。濃度加和模型(concentration addition, CA)是在混合物整個CRC上的評估方法，且能用于大多數(shù)混合物毒性的評估[14-16]。

越來越多的研究表明，污染物的毒性是隨時間逐漸產生并發(fā)展的一個動態(tài)變化過程，且不同的污染物隨時間可能有不同的毒性變化規(guī)律[17-18]。如三嗪類除草劑、離子液體、氨基糖苷類抗生素等及其混合物對發(fā)光菌青海弧菌Q67的毒性具有明顯的時間依賴性，即毒性隨著時間的延長而逐漸增加，但不同的毒物，其毒性增加的幅度不同，有的污染物甚至出現(xiàn)了明顯的濃度-效應曲線(CRC)類型的轉化，即從J型轉變成S型[19]。王猛超等[15]的研究發(fā)現(xiàn)農藥三嗪類除草劑及其混合物具有明顯的時間依賴性。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素及其混合物對發(fā)光菌具有明顯的時間依賴毒性。這表明污染物的毒性除與濃度相關外，與暴露時間也密切相關。因此，僅依據(jù)污染物在某一特殊暴露時間點的濃度-效應數(shù)據(jù)已不能說明實際環(huán)境體系的真實情況，必須全面系統(tǒng)采集這些污染物在不同暴露時間對暴露生物的毒性數(shù)據(jù)，并進行聯(lián)合毒性作用隨時間逐漸變化的動態(tài)規(guī)律分析，才能揭示污染物間發(fā)生毒性相互作用的機制，才能客觀準確評價環(huán)境污染物的潛在風險[21-22]。

氨基糖苷類抗生素(AG)是一類廣泛應用于抗革蘭氏陰性細菌活性的廣譜性抗生素，因其低成本和高療效，在發(fā)達國家廣泛應用于治療囊性纖維化患者和早產兒，以及各種嚴重或頑固的細菌感染，包括結核病[23]。然而，許多AG抗生素因具有較高的水溶性，很容易進入水體，進而威脅到水生生物甚至人類的健康和生存[20]。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，綠藻和細菌是食物鏈的2個重要的環(huán)節(jié)，分別位于位于食物鏈的頂端和末端，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著生產者和分解者的角色。因此，開展AG抗生素對生態(tài)系統(tǒng)中2種模式生物綠藻和細菌具有重要的實際環(huán)境意義。而目前關于AG抗生素對水生生物的在某一特殊暴露時間點的毒性已有報道[18,24]，而關于AG類抗生素的毒性及其聯(lián)合毒性相互作用(協(xié)同或拮抗作用)隨暴露時間變化的分析則更少[20,25]。

因此，本文擬以廣泛應用的3種氨基糖苷類抗生素：硫酸安普霉素(apramycin sulfate, APR)、雙氫鏈霉素(dihydrostreptomycin, DIH)和硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate, STS)為研究對象，以水生生態(tài)系統(tǒng)中生產者綠藻如蛋白核小球藻(CP)和分解者細菌如發(fā)光菌青?；【鶴67為受試生物，采用UD-Ray法設計三元混合物體系(共安排5條具有不同濃度配比的混合物射線)，應用時間依賴微板毒性分析方法(t-MTA)系統(tǒng)測定抗生素及其混合物射線在不同暴露時間分別對2種指示生物的毒性效應，采用CA模型分析AG抗生素在不同暴露時間的聯(lián)合毒性相互作用(協(xié)同或拮抗作用)，并分析毒性相互作用類型隨時間的變化規(guī)律，實驗結果將為客觀、準確地評價抗生素的環(huán)境風險提供數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　材料、儀器及藥品

1.1.1材料

實驗菌種青?；【鶴67 (Vibrio qinghaiensis sp. ─Q67，簡稱Q67)購自北京濱松光子技術股份有限公司，菌種的培養(yǎng)與保存參照文獻[19]。蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa，簡稱CP)購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫(FACHB)，編號為FACHB-5。藻種的培養(yǎng)與保存參照文獻[18]。

表1　3種氨基糖苷類(AG)抗生素的基本理化性質Table 1　Basic physicochemical properties of three aminoglycosides (AG) antibiotics

表2　5條抗生素混合物射線的濃度比(pi)Table 2　Concentration ratio (pi) of five anbiotic mixture rays

注：Q67為青?；【鶴67；CP為蛋白核小球藻。

Note: Q67 stands forVibrio qinghaiensis sp.─Q67; CP stands for Chlorella pyrenoidosa.

1.1.2儀器

實驗中用到的主要設備包括Synergy 2酶標儀(美國BioTek伯騰儀器有限公司)、70SW-CJ-IF超凈工作臺(三發(fā)儀器有限公司)、FA1004型五位電子天平(天津天馬衡基儀器有限公司)、YX280A手提式壓力蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；Genex移液器(10～100 μL)(寶予德有限公司)和BS-2E數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱(上海梅香儀器有限公司)。

1.1.3藥品

3種抗生素：硫酸安普霉素(APR)、雙氫鏈霉素(DIH)、硫酸鏈霉素(STS)均購自上海原葉生物科技有限公司，其理化性質列于表1中。儲備液用Mill-Q水配制，并于4 ℃冰箱中保存、備用。

1.2　混合物設計

為系統(tǒng)考察混合物的毒性隨濃度和時間的變化規(guī)律，應用均勻設計射線(UD-Ray)[9]法設計3種抗生素三元混合物體系5條射線(R1, R2, …, R5)，每條混合物射線的組分及其濃度配比pi值列于表2中。

1.3　時間毒性測試

抗生素及其混合物對發(fā)光菌和綠藻的時間毒性測定分別采用基于青?；【鶴67[20]和蛋白核小球藻CP[18]的時間毒性微板分析法(t-MTA)。對于發(fā)光菌，采用不透明的96孔白板作為實驗暴露載體，而對于綠藻則采用透明的96孔微板作為實驗載體。微板設計方法：在微板4周共36個孔各加入200 μL水防止產生邊緣效應。余下的60個孔第2、6、7及11列共24個孔中分別加入100 μL純水作為空白對照，第3列共6個孔以及第8列共6個孔分別加入按稀釋因子設計的12個不同濃度的毒物100 μL，第4和5列為第3列的平行實驗以及第9和10列為第8列的平行實驗，然后在60個孔中均加入100 μL已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的發(fā)光菌液或綠藻溶液，使各孔中的試液總體積為200 μL，每個濃度至少重復3塊板。

對于加入發(fā)光菌的微板，則置于恒溫培養(yǎng)箱中(22±1) ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在暴露時間為0.25 h、2 h、4 h、8 h、12 h時取出并置于讀板機中測定其發(fā)光強度，并計算微板中各個孔中不同濃度的毒物對發(fā)光菌的發(fā)光抑制率[20]。

對于加入綠藻的微板，則置于溫度(22±1) ℃、光強為5 000 lux的光照條件下的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在暴露時間為12 h、24 h、48 h、72 h、96 h時取出，并置入美國Biotek微板光度計中測定其光密度OD690的值，并計算微板各個孔中不同濃度的毒物對綠藻的生長抑制率[18]。

1.4　時間毒性數(shù)據(jù)處理與擬合

為了揭示不同暴露時間、不同濃度污染物對發(fā)光菌或綠藻的毒性變化規(guī)律，采用兩參數(shù)非線性函數(shù)Weibull(1)和Logit(2)對不同時間節(jié)點的濃度-效應數(shù)據(jù)進行非線性最小二乘擬合，擬合相關系數(shù)(correlation coefficient，簡稱R)與均方根誤差(root mean square error, RMSE)最小者為最優(yōu)[26]。2個用于描述實驗毒性數(shù)據(jù)的非線性函數(shù)公式如下：

E=1/(1+exp(-α-β log10(c)))

(1)

E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))

(2)

式中α、β是Weibull和Logit的位置與斜率參數(shù)，E為效應即污染物對發(fā)光菌的發(fā)光抑制率或對綠藻的生長抑制率；c是污染物的濃度。

1.5　混合物毒性相互作用分析

用于混合毒性評估參考模型CA見公式(4)[16]，當觀測毒性大于加和參考模型預測毒性時稱混合物產生協(xié)同作用，小于預測毒性時則稱有拮抗作用，若等于預測毒性則稱為無相互作用或加和作用。

(3)

式中ci表示混合物中產生某一效應x%時組分i的濃度，ECx,i表示混合物中第i個化合物單獨存在時所產生的效應與混合物總效應x%相同時的濃度，E(cmix)表示混合物產生的總效應，E(ci)表示表示混合物中第i個化合物單獨存在時所產生的效應。

2　結果(Results)

2.1　3種AG抗生素對發(fā)光菌和綠藻的時間依賴毒性

3種AG抗生素在不同時間節(jié)點的濃度-效應數(shù)據(jù)(點)以及通過非線性最小二乘擬合方法的擬合結果列于表3中，其濃度-效應曲線繪于圖1中。

從表3可看出，Logit函數(shù)能較好地擬合3種抗生素對發(fā)光菌Q67和綠藻CP在不同暴露時間的濃度-效應數(shù)據(jù)，擬合相關系數(shù)R除在開始的個別暴露時間點均在0.9以上，均方根誤差RMSE小于0.9。從圖1可看出，3種抗生素對2種指示生物的濃度-效應曲線(CRCs)均是隨暴露時間延長從下至上依次排列，表明3種抗生素的毒性均具有明顯的時間依賴毒性，即隨著暴露時間的延長，3種抗生素對2種指示生物的毒性逐漸增強。但不同抗生素對于同一種指示生物發(fā)光菌或綠藻的毒性隨暴露時間的延長變化規(guī)律不同，如抗生素APR和DIH對發(fā)光菌在0～2 h內，沒有明顯毒性，但2 h后，毒性迅速增強，8 h后毒性增強緩慢；而STS對2種指示生物的毒性從暴露開始就逐漸增強，在2 h增加速率最快，此后開始變緩。以半數(shù)效應濃度的負對數(shù)值(pEC50值)為毒性大小指標，3種抗生素對于Q67和CP在暴露時間分別為12 h和96 h時的毒性大小順序均為：STS > DIH > APR (表3)，但2種水生生物對3種抗生素及其混合物的響應不同，總的來說發(fā)光菌的靈敏度要高于蛋白核小球藻(圖1和表3)

表3　3種抗生素對Q67和CP的濃度-效應數(shù)據(jù)Logit擬合的參數(shù)、統(tǒng)計量、半數(shù)效應濃度及其負對數(shù)值Table 3　The parameters of fitting function Logit, statistics, median effect concentration (EC50) and its negative logarhim for the three antibiotics’ concentration-response data towards Q67 and CP

注：α、β為擬合參數(shù)；RMSE和R分別是均方根誤差和擬合相關系數(shù)；EC50為半數(shù)效應濃度；pEC50為EC50的負對數(shù)。

Note:α, β are fitting parameters; RMSE and R are root mean square error and fitting correlation coefficient, respectively; EC50is median effect concentration; pEC50is -logEC50.

2.2　AG抗生素三元混合物對發(fā)光菌和綠藻的時間依賴毒性

采用UD-Ray法設計的三元混合物體系的5條射線分別對2種指示生物在不同暴露時間的擬合，結果繪于圖2中。圖2顯示CRC與單個物質的毒性具有類似的時間依賴性。

圖3是5條混合物射線分別對Q67和CP的pEC50值隨時間的變化曲線圖。從圖3可以看出，3條混合物射線對Q67的pEC50值均隨暴露時間的延長而單調增加，且增加的趨勢相似，但3條混合射線對CP的pEC50值隨時間單調增加的規(guī)律不同，R1和R3在72 h才達到50%的抑制率，而其余3條射線則是在48 h達到50%的抑制率。圖2和圖3也顯示，2種指示生物對AG抗生素的三元混合物體系的毒性響應有差異，發(fā)光菌的響應比綠藻的靈敏。

2.3　AG抗生素混合物的時間依賴毒性相互作用

三元混合物的5條射線對Q67和CP的濃度-效應數(shù)據(jù)點及其CRC曲線以及CA預測結果繪于圖4中和圖5中(由于在開始的2個時間點，所有的混合物射線都沒有明顯的毒性，故圖4和圖5中沒列出)。

圖1　3種抗生素對Q67和CP在不同暴露時間的濃度-效應曲線(CRCs)Fig. 1　Concentration-response curves of three antibiotics at different time points for Q67 and CP

圖2　三元混合物射線不同時間節(jié)點對Q67和CP的CRCs關系Fig. 2　The CRCs of ternary mixture rays at different exposure times for Q67 and CP

圖4顯示，所有混合物射線的CA預測線基本上都在實驗觀測CRC的置信區(qū)間內，且?guī)缀跖c實驗觀測CRC重疊，表明CA能很好地預測所有混合物射線在不同暴露時間對發(fā)光菌的毒性，即3個抗生素的三元混合物對青?；【鶴67的毒性呈經典的加和作用，且不隨暴露時間的延長和濃度的增加而發(fā)生變化。圖5顯示三元混合物的5條射線中，CA對R2、R3和R4的預測線也落在實驗觀測CRC的置信區(qū)間，即3條射線也為加和作用，且不隨暴露時間和暴露濃度的變化而變化。而CA對R1和R5的預測線在72 h和96 h落在了觀測CRC的上方，表明2條射線在這2個暴露時間點的毒性呈現(xiàn)拮抗作用，且隨暴露時間的變化而變化，其中R1在暴露時間48 h呈加和作用，在72 h則呈明顯的拮抗作用，然后拮抗作用開始減弱；R5則從48 h的加和作用，變化為96 h的弱拮抗作用，2條射線的拮抗作用均發(fā)生在中濃度區(qū)。

3　討論(Discussion)

越來越多的研究表明部分污染物具有明顯的時間依賴毒性，但不同的污染物具有不同的時間毒性變化規(guī)律[18, 27]。本研究中的3種抗生素及其三元混合物射線對2種指示生物的毒性均表現(xiàn)出明顯的時間依賴性，但不同抗生素對于指示生物的毒性隨暴露時間的延長變化規(guī)律不同。因此在進行污染物生態(tài)毒性評價時應同時考慮濃度與時間2個因素[18]，才能全面了解污染物的毒性效應，更深入地了解污染物的毒性作用機制與途徑。

不同的水生生物對同一種化合物或混合物的毒性響應可能不同[28]。因此，本研究比較3種抗生素及其混合物對2種指示生物發(fā)光菌和綠藻的毒性，結果如圖1和表3顯示，2種水生生物對3種抗生素的響應不同，發(fā)光菌的靈敏度要高于蛋白核小球藻。這可能是由于綠藻的毒性指標為生長抑制率，是通過測定藻溶液在某一特定波長的吸光度值來計算得到的，實驗中死亡的藻細胞可能對結果有一定的影響，而發(fā)光菌的毒性指標為發(fā)光抑制毒性，通過計算暴露前后發(fā)光菌的發(fā)光值而得到的，受損或死亡的菌體發(fā)光很弱或不發(fā)光，而對于菌落的發(fā)光值影響很小。馮曉娜等[29]也研究發(fā)現(xiàn)有機污染物對不同模式生物的毒性有差異，對發(fā)光菌的毒性明顯高于對魚的毒性。

混合物的毒性相互作用可能具有濃度或濃度比依賴性[30]。因此，為了解混合物組分在整個空間濃度配比的相互作用情況，混合物的設計顯得極其重要的。在混合物的設計方法中，UD-Ray[9]是將簡單的混合物聯(lián)合毒性研究推向真正的多組分的復雜混合物領域，且能以最少的實驗工作最有效地考察具有各種組分濃度空間配比的混合污染物的聯(lián)合毒性。因此，在本研究中，采用均勻設計射線法(UD-ray)，設計了一組三元混合物體系共計5條具有不同組分濃度配比的混合物射線，并應用時間毒性微板分析法系統(tǒng)測定了5條混合物射線分別對2種指示生物在不同暴露時間的聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)。結果顯示具有不同濃度配比的混合物射線對發(fā)光菌Q67呈經典的加和作用。Zhang等[20]的研究也發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素二元混合物對發(fā)光菌Q67在不同暴露時間的毒性均呈經典的加和作用。但三元混合物體

圖3　三元混合物射線的pEC50值隨時間變化曲線Fig. 3　The changing curves of pEC50 values with the time for the ternary mixture rays

系APR-DIH-STS的5條射線對蛋白核小球藻CP的毒性，既有加和作用也有拮抗作用，且拮抗作用隨暴露時間和暴露濃度的變化而變化。這表明抗生素聯(lián)合毒性相互作用與指示生物和暴露時間有關。Liu等[28]也報道同一組混合物可能對不同的指示生物呈現(xiàn)出不同甚至是截然相反的毒性相互作用類型。

圖4　三元AG抗生素混合物體系對Q67的實驗觀察濃度-效應數(shù)據(jù)及其95%置信區(qū)間以及CA預測結果注：圖中黑色分散的點(·)，實驗點；黑色實線(—)，擬合線；紅色虛線(---)，CA預測線；藍色虛點線(--)，95%置信區(qū)間；下同。Fig. 4　The observed concentration-response data together with their 95% confidence intervals and predicted curves by CA for the ternary AG antibiotic mixture systems towards Q67Note: The black dispersed point, black solid line, red dash line and the blue dash dot line in figure refer to the observed data, fitted line, CA prediction line and 95% confidence interval, respectively; the same below.

同一指示生物CP，UD-Ray設計的不同濃度配比射線的毒性相互作用也不相同，有的射線呈加和作用，而有的射線呈拮抗作用，且不同射線，拮抗作用的程度不同，AG抗生素毒性及其聯(lián)合毒性相互作用與暴露的生物、混合物組分的濃度配比、暴露時間等有關。同時表明，UD-Ray法與固定組分濃度配比的FCRR法和FD相比，更適于多組分混合物聯(lián)合毒性作用的研究。

綜上，3種AG抗生素APR、DIH和STS及其三元混合物射線對2種指示生物發(fā)光菌Q67和蛋白核小球CP具有明顯的時間依賴毒性，但Q67對3種抗生素及其混合物射線的響應比CP的靈敏。以半數(shù)效應濃度的負對數(shù)pEC50值為毒性大小指標，3種AG抗生素對2種指示生物的毒性大小順序隨暴露時間而變化，對于Q67和CP在暴露時間分別為12 h和96 h時的毒性大小順序均為：STS > DIH > APR。5條具有不同組分濃度配比的AG抗生素混合物射線對Q67在不同暴露時間的毒性均呈加和作用，但對CP的毒性既有加和作用也有拮抗作用，且拮抗作用具有濃度比依賴性和時間依賴性，表明AG抗生素毒性及其聯(lián)合毒性相互作用與暴露的生物、混合物的濃度、組分的濃度配比、暴露時間等有關。

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