侯天芳，廖紀(jì)萍 ，馬元元 ，張成 ，王廣發(fā),*

1. 北京大學(xué)第一醫(yī)院呼吸和危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100034 2. 北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100034

隨著我國(guó)工業(yè)和現(xiàn)代化的快速發(fā)展，交通機(jī)動(dòng)車尾氣污染物排放量持續(xù)增高，大氣污染危害成分中首當(dāng)其沖的是大氣顆粒物，特別是可入肺的細(xì)顆粒物(空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑≤2.5 μm的顆粒物，PM2.5)，對(duì)人群危害風(fēng)險(xiǎn)損傷強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于臭氧(O3)、二氧化硫(SO2)等氣態(tài)污染物，成為對(duì)人群危害風(fēng)險(xiǎn)威脅最大、代表性最強(qiáng)的大氣污染物。流行病學(xué)已經(jīng)證實(shí)PM2.5與心肺呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率有明顯的相關(guān)關(guān)系[1-2]。權(quán)威調(diào)查顯示，在中國(guó)室內(nèi)和室外空氣污染導(dǎo)致2 500萬(wàn)多人健康壽命損失和120萬(wàn)人過(guò)早死亡，但是PM2.5引起機(jī)體損害的具體機(jī)制目前尚不十分清晰[3]。近來(lái)有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致病中亦發(fā)揮作用[4-5]，甚至與神經(jīng)退行性疾病、精神性疾病、帕金森病等疾病的發(fā)生發(fā)展亦有相關(guān)[6-8]。

MicroRNAs是一類長(zhǎng)度為19～23 nt的短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA。廣泛存在于各種細(xì)胞中，主要參與真核生物的發(fā)育、生長(zhǎng)、分化、免疫反應(yīng)和適應(yīng)壓力等多種生理過(guò)程[9]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)microRNAs在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)引起的毒理學(xué)過(guò)程中起著十分重要的作用[10]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，空氣污染能夠主要引起microRNA-9，microRNA-223，microRNA-10b，microRNA-143等miRNAs的改變[11]，不管是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)暴露于炭黑顆粒物、顆粒物、柴油機(jī)廢棄顆粒物后，microRNAs表達(dá)會(huì)發(fā)生明顯的改變[12-15]。

MicroRNAs穩(wěn)定存在于血液及組織中，因此作為一種臨床早期診斷的新標(biāo)記物逐漸受到重視，本研究通過(guò)PM2.5暴露后建模小鼠肺組織芯片篩選，找到microRNAs差異表達(dá)譜，選用三大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交集分析預(yù)測(cè)靶基因，根據(jù)生物信息學(xué)做GO和KEGG通路分析，從而預(yù)測(cè)及分析大氣污染相關(guān)疾病的作用機(jī)制通路，為后續(xù)科研實(shí)驗(yàn)奠定理論依據(jù)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑材料

實(shí)驗(yàn)用microRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及RT-qPCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；ABI 7500熒光定量PCR儀。

1.1.2PM2.5顆粒的采集、提取和懸液制備

顆粒物的采樣點(diǎn)為北京大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)科樓樓頂，應(yīng)用Staplex PM2.5大流量采樣器，于2016年1月連續(xù)采樣96 h。將附有PM2.5顆粒的玻璃纖維濾膜剪成小塊于燒杯；加入無(wú)菌超純水，低溫超聲以混勻懸浮液，使用6層紗布過(guò)濾懸液，低溫冷凍干燥收獲顆粒物于-20 ℃冰箱備用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)小鼠的體重稱取PM2.5顆粒物，于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前一天用生理鹽水配制不同濃度的細(xì)顆粒物混懸液，超聲振蕩混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，使用前再次超聲振蕩混勻?/p>

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(SCXK(京)2012-0001)提供的SPF級(jí)8周齡雄性BALB/c小鼠(25±2 g)，在北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SYXK(京)2014-0010)飼養(yǎng)。小鼠自由進(jìn)食消毒顆粒飼料及水，室溫23～25 ℃，12 h光:12 h暗，濕度25%～30%。通過(guò)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查(動(dòng)物倫理編號(hào)：J201609)，小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、低劑量暴露組(PM2.5，2.5 mg·kg-1)、高劑量組(PM2.5，20 mg·kg-1)，每組6只，建模方法參考本課題組既往研究[16]采用氣管滴注方法進(jìn)行，用5%水合氯醛麻醉處理，麻醉后的小鼠仰臥固定于操作板，借助冷光源透視，清晰看到聲門(mén)裂，用小型注射器與改裝后的留置針吻合固定，進(jìn)行快速氣管滴注(滴注量為50 μL·次-1)，一周滴注2次，氣管滴注14 d結(jié)束后過(guò)量麻醉處死動(dòng)物并取材。

1.2.2小鼠肺組織提取RNA并芯片處理

隨機(jī)從3組中選出3只小鼠，獲取肺組織后提取RNA，樣品總RNA利用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)定量，檢測(cè)RNA完整性使用安捷倫生物分析軟件，樣本檢測(cè)合格后進(jìn)行芯片處理，嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行(委托上海歐易公司進(jìn)行芯片檢測(cè))。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

嚴(yán)格按照北京全式金生物技術(shù)有限公司操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行microRNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄參數(shù)條件設(shè)置為37 ℃、60 min，85 ℃、5 s滅活。后續(xù)進(jìn)行qRT-PCR，設(shè)置反應(yīng)條件為50 ℃、2 min 滅活UNG 酶，94 ℃、30 s 預(yù)變性，94 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本均采用三復(fù)孔。表達(dá)水平以2-ΔΔCT表示，引物序列如下：

mmu-miR-139-5p：5’-TCTACAGTGCACGTGTCTCCAG-3’；mmu-miR-691:5’-ATTCCTGAAGAGAGGCAGAAAA-3’； mmu-miR-340-3p:5’-TCCGTCTCAGTTACTTTATAGC-3’；U6 forward：5'-CTCgCTTCggCAgCACA-3'； U6 reverse：5'-AACgCTTCACgAATTTgCgT-3'。

1.3　生物信息學(xué)分析(GO和KEGG分析)

應(yīng)用TargetScan，PITA，microRNAorg這三大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行microRNAs靶基因預(yù)測(cè)，輸入差異表達(dá)的miRNAs，取三大軟件共同預(yù)測(cè)到的靶基因的交集，再對(duì)靶基因進(jìn)一步進(jìn)行GO分析，主要包括三大部分，分別為生物過(guò)程(biological process)、分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)，并采用KEGG分析主要參與的信號(hào)通路，綜合分析富集結(jié)果。其中利用T檢驗(yàn)得到的差異顯著性P值和標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)值的差異倍數(shù)fold change值進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為fold change≥2.0且P≤0.05。

2　結(jié)果(Results)

2.1　肺組織提取RNA純度測(cè)定

結(jié)果顯示各組RNA樣本的OD260/OD280比值均在1.8～2.2之間且28S/18S≥0.7，28S rRNA 和 18S rRNA 條帶清晰，5S rRNA條帶很弱，經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)檢測(cè)RNA完整性好，達(dá)到芯片實(shí)驗(yàn)上機(jī)要求。

2.2　PM2.5暴露后小鼠肺組織microRNAs變化

大氣細(xì)顆粒物染毒后小鼠肺組織microRNAs有顯著差異變化，表1結(jié)果顯示，高劑量處理組與對(duì)照組比較有4個(gè)microRNAs上調(diào)，低劑量處理組與對(duì)照組比較有2個(gè)microRNAs上調(diào)，高劑量組與低劑量組比較，有4個(gè)miRNAs上調(diào)(標(biāo)準(zhǔn)為fold change值>= 2.0且P值<= 0.05)。

表1　PM2.5暴露對(duì)肺組織microRNAs的影響Table 1　microRNAs alterations in mice lung tissue after PM2.5 exposure

2.3　實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證差異表達(dá)的microRNAs

實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNAs的結(jié)果如圖1所示。

2.4　差異表達(dá)明顯的microRNAs靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

經(jīng)芯片篩查發(fā)現(xiàn)10個(gè)差異表達(dá)的microRNAs，其中綜合考慮上調(diào)的倍數(shù)以及2組進(jìn)行兩兩比較的結(jié)果，利用TargetScan，PITA，microRNAorg數(shù)據(jù)對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，其中有4個(gè)miRNAs可以預(yù)測(cè)到靶基因，分別是miR-139-5p、miR-691、miR-340-3p及miR-450b-3p，具體預(yù)測(cè)靶基因結(jié)果見(jiàn)表2及圖2。

表2　microRNAs 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果Table 2　Results of microRNAs targets

圖1　差異表達(dá)的miRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果(n=6)注：與對(duì)照組比較 *P<0.05, **P<0.01。Fig. 1　Validation of differentially expressed microRNAs (n=6)Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with the control group.

圖2　3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到的靶基因交集圖注： A, miR-139-5p預(yù)測(cè)靶基因數(shù); B, miR-691及miR-340-3p預(yù)測(cè)靶基因數(shù); C, miR-450b-3p預(yù)測(cè)靶基因數(shù)。Fig. 2　The target gene intersection map predicted by three databasesNote: A, results of miR-139-5p targets; B, results of miR-691 and miR-340-3p targets; C, results of miR-450b-3p targets.

2.5　差異表達(dá)miRNAs靶基因顯著富集GO和KEGG分析結(jié)果

差異表達(dá)miRNAs靶基因顯著富集GO和KEGG分析結(jié)果如表3和圖3所示。

3　討論(Discussion)

2013年以來(lái)，以PM2.5為主要污染成分的霧霾頻發(fā)，是我國(guó)目前最受關(guān)注的重大環(huán)境問(wèn)題之一，北京灰霾污染尤甚。本研究的PM2.5采集于北京冬季霧霾高發(fā)期(位于北京大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)科樓頂樓)，盡管大氣顆粒物成分復(fù)雜，表面附著多種有毒物質(zhì)，但本研究采用大氣顆粒物染毒小鼠探索分子毒理學(xué)機(jī)制過(guò)程有其特有的參考價(jià)值。

研究證實(shí)，miRNAs與其靶mRNA的3′端非編碼區(qū)(3'-UTR)互補(bǔ)結(jié)合，在翻譯水平上特異性抑制基因表達(dá)[11]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，約60%的編碼蛋白基因是受microRNAs調(diào)控的[17]，值得注意的是，microRNA很可能與很多種不同的靶基因有調(diào)控關(guān)系[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間大氣顆粒物暴露后人體外周血中microRNAs(let-7g-5p，miR-126-3p，miR-130a-3p，miR-146a-5p，miR-150-5p, miR-191-5p和 miR-23a-3p)發(fā)生變化，并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其靶基因(CCR3，CD40，COL1A2，CSF1，CXCL12，CXCL8，CXCR4，IL1F10，IL36A，IL36B，IL36G，IL36RN，IL37，IL6，PDGFB和VCAM1)參與了心血管疾病相關(guān)的信號(hào)通路[19]。

第一個(gè)人類全基因組草圖已經(jīng)于2010年完成，目前對(duì)于基因組的研究也進(jìn)入了功能基因組時(shí)代，即后基因組時(shí)代。生物信息學(xué)中的GO分析可指導(dǎo)不同樣本的差異基因可能和哪些基因功能的改變有關(guān)，而KEGG則著重于找出廣泛參與的信號(hào)通路，確定參與發(fā)生發(fā)展過(guò)程的差異表達(dá)基因[20-21]。目前針對(duì)軟件預(yù)測(cè)而得的靶基因群，最常用的生物信息學(xué)方法包括：GO (Gene Ontology) 和KEGG分析 (the Kyoto analysis of the Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNAs所調(diào)控的靶基因顯著富集在34個(gè)GO通路(P<0.001)，具體為15個(gè)GO涉及到生物過(guò)程，主要包括：RNA拼接，RNA轉(zhuǎn)錄酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，DNA模板，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、激活JNKK活動(dòng)等；9個(gè)GO涉及細(xì)胞組分，主要包括：細(xì)胞核、質(zhì)、膜及突觸等；10個(gè)GO涉及分子功能，主要包括：蛋白結(jié)合、RNA和DNA結(jié)合、RNA聚合酶II啟動(dòng)子結(jié)合、R-SMAD 結(jié)合等。將差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行Pathway富集分析,有助于找到實(shí)驗(yàn)條件下顯著性差異變化的生物學(xué)調(diào)控通路。在Pathway分析(P<0.05，見(jiàn)圖3 A B C)中，3組進(jìn)行通路比較，富集于軸突導(dǎo)向通路值得關(guān)注，還有突觸囊泡循環(huán)、五羥色胺神經(jīng)突觸、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)等，都提示差異miRNAs富集信號(hào)通路指向中樞神經(jīng)發(fā)育以及神經(jīng)退化性疾病的發(fā)生發(fā)展。生長(zhǎng)錐是位于神經(jīng)突起末端的一個(gè)扇形結(jié)構(gòu)，其受體可選擇性識(shí)別某些導(dǎo)向信號(hào)，通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而指導(dǎo)軸突識(shí)別達(dá)到正確的位置，可見(jiàn)軸突導(dǎo)向是神經(jīng)發(fā)育的一個(gè)重要分支[22]。Bellon等[23]發(fā)現(xiàn)，miR-182在體內(nèi)外可調(diào)控由Slit2介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突導(dǎo)向，且生長(zhǎng)錐的miR-182抑制cofilin-1局部蛋白復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄翻譯。其中，靶基因Arhgef12、Sema4g、Epha5、Ablim1參與了這個(gè)軸突導(dǎo)向重要過(guò)程，EphA5是Ephrins家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，其配體是Ephrin-A5[24]。Cooper等[25]研究發(fā)現(xiàn)，EphA5與其配體Ephrin-A5的相互作用與中腦DA神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在坐骨神經(jīng)損傷的大鼠，在損傷部位的miR-340表達(dá)失調(diào)影響去除細(xì)胞碎片和軸突再生[26]。而miR-691和miR-450與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)性鮮見(jiàn)報(bào)道。

圖3　PM2.5暴露后小鼠肺組織差異表達(dá)microRNAs靶基因KEGG分析和軸突導(dǎo)向通路注：A為PM2.5低劑量組與對(duì)照組比較的差異表達(dá)miRNAs靶基因KEGG分析；B為PM2.5高劑量組與PM2.5低劑量組比較的差異表達(dá)miRNAs靶基因KEGG分析；C為PM2.5高劑量組與對(duì)照組比較的差異表達(dá)miRNAs靶基因KEGG分析。Fig. 3　KEGG analysis and axon guidance pathway of differentially expressed lung tissue microRNAs after exposed to PM2.5Note: A, KEGG analysis of differentially expressed microRNAs in low dose group compared to the control group; B, KEGG analysis of differentially expressed microRNAs in high dose group compared to low dose group; C, KEGG analysis of differentially expressed microRNAs in high dose group compared to the control group.

本研究KEGG分析還富集于幾條癌癥通路，包括：結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、甲狀腺癌、急性髓系白血病、前列腺癌等，提示差異表達(dá)microRNAs參與癌癥通路的某個(gè)作用階段，發(fā)揮致病作用。Miyoshi等[27]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌患者中檢測(cè)到miR-139-5p的升高，并且顯著縮短無(wú)復(fù)發(fā)生存率，小鼠模型中發(fā)現(xiàn)miR-139-5p的過(guò)表達(dá)可以加重結(jié)直腸患者的腹膜擴(kuò)散。然而，Wang等[28]分別采用正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者的組織取樣進(jìn)行microRNAs深度測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，結(jié)直腸癌患者中miR-139-5p，miR-204-5p，miR-125b-5p，miR-100-5p和miR-30a-5p表達(dá)是明顯下調(diào)的。再者研究顯示，miR-124，miR-137和miR-340通過(guò)抵消Warburg效應(yīng)來(lái)修復(fù)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)，主要由于調(diào)節(jié)替代PKM基因剪接來(lái)完成[29]。也有研究證實(shí)：可用miR-10b，miR-139-5p，miR-130b 和 miR-199b-5p來(lái)檢測(cè)腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移情況，這4個(gè)microRNAs與腎透明細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，可以作為生物標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)預(yù)后[30]。在間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰腺β細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)microRNAs(包括：miR-18a-5p，miR-19b-5p，miR-30d-3p，miR-124，miR-146a-5p， miR-184；miR-335和 miR-433-5p)的過(guò)表達(dá)是和胰腺β細(xì)胞的分化相平衡的[31]。

本文重點(diǎn)研究并驗(yàn)證了大氣污染暴露后小鼠肺組織中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)明顯的miR-691、miR-139-5p、miR-340-3p及miR-450，利用生物信息學(xué)分析揭示了其改變與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、多種癌癥通路、調(diào)控多能干細(xì)胞分化等通路有相關(guān)性，為進(jìn)一步深入研究大氣顆粒物引起的毒理學(xué)機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)證據(jù)。

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