姜麗思，張倩茹，王建美，李斯雯，宋婕,3，崔偉娜，劉宛

1. 中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所 污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110016 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3. 遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，沈陽(yáng) 110036 4. 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，上海 201418

佳樂麝香(HHCB)是一種典型的半揮發(fā)疏水性多環(huán)類人工合成麝香[1]，具有特殊的香味、良好的提香和定香能力以及價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已作為工業(yè)香料被廣泛地應(yīng)用于日用化工產(chǎn)品，如香水、面霜、洗發(fā)水、沐浴露、柔順劑、肥皂和洗衣粉等[2]。由于被大量使用，HHCB被持續(xù)不斷地釋放到環(huán)境中，所產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)已引起各國(guó)政府及學(xué)界的高度重視[3]。已有研究表明，HHCB極易通過食物攝入、吸入吸收和皮膚接觸等途徑進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，抑制細(xì)胞抵御化學(xué)物質(zhì)的能力，并在體內(nèi)蓄積進(jìn)而導(dǎo)致潛在危害[2-4]。毒理學(xué)研究也表明，其對(duì)水生生物具有亞急性毒性、弱的雌激素作用與抗雌激素效應(yīng)，以及發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾等效應(yīng)[5-7]。HHCB能夠通過污水灌溉、污泥農(nóng)用、大氣沉降和垃圾填埋等多種途徑進(jìn)入并積累于環(huán)境中，從而提高其對(duì)生物的脅迫水平。目前，針對(duì)HHCB的研究主要集中于水體、沉積物和污泥中的分布特征[8-9]，對(duì)其毒性效應(yīng)的研究多局限于水生生態(tài)系統(tǒng)，大部分也是針對(duì)水生植物、魚類等細(xì)胞毒性測(cè)試[10]，而對(duì)于陸生植物基因組DNA損傷方面的研究工作鮮有報(bào)道。

隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性(Random Amplification of Polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)是美國(guó)學(xué)者Williams和Welsh于1990年首先創(chuàng)立的，該技術(shù)是利用隨機(jī)引物對(duì)目的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)[11-12]。由于其具有操作簡(jiǎn)單、通用性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，RAPD技術(shù)被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析、土壤酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)分析等生物學(xué)領(lǐng)域[13]。在生態(tài)毒理學(xué)研究中，RAPD技術(shù)多以人和動(dòng)物為研究對(duì)象[14-17]，近年來(lái)才逐漸應(yīng)用于植物，例如，研究逆境脅迫下植物的基因突變[18-20]，檢測(cè)污染物對(duì)植物脅迫造成的DNA損傷，包括DNA加合物、插入缺失、斷裂、堿基置換等[20-23]。目前，利用RAPD技術(shù)已成功檢測(cè)出重金屬、雌激素、多環(huán)芳烴、農(nóng)藥等多種污染物脅迫條件下對(duì)細(xì)胞DNA造成的損傷和突變[31-33]。因此，本研究選用RAPD技術(shù)來(lái)探究不同濃度HHCB脅迫是否能夠?qū)Υ筇镒魑锾}卜基因組造成DNA損傷，以期為農(nóng)田污染生態(tài)毒理學(xué)診斷提供快速靈敏的生物標(biāo)記物，為制定農(nóng)田污染安全預(yù)警標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)和方法指導(dǎo)。

本研究選用大田常見作物十字花科植物蘿卜(Raphanus sativus L.)為受試植物，通過發(fā)芽實(shí)驗(yàn)以及RAPD分析，研究HHCB對(duì)蘿卜發(fā)芽率、芽伸長(zhǎng)、根伸長(zhǎng)及DNA損傷的影響，探究各項(xiàng)表觀生長(zhǎng)指標(biāo)和基因組對(duì)HHCB脅迫的敏感程度，分析脅迫造成的DNA損傷狀態(tài)，并通過不同濃度處理間的遺傳相似性比較，篩選出可用于檢測(cè)HHCB遺傳毒性效應(yīng)的敏感生物標(biāo)記物，為農(nóng)業(yè)實(shí)踐提供理論和方法學(xué)指導(dǎo)。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　儀器與試劑

主要儀器：分子凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))；小型臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；植物培養(yǎng)箱(Panasonic，日本)；PCR儀(Biometra，德國(guó))；核酸蛋白測(cè)定儀(Eppendorf，德國(guó))。

主要試劑：佳樂麝香(50%鄰苯二甲酸二乙酯溶液，北京祥云興業(yè)科技有限公司)；新型植物基因組DNA提取試劑盒(北京康維世紀(jì)生物科技有限公司)；LA Taq(TaKaRa，日本)；dNTP Mixture(TaKaRa，日本)；DL2000 DNA Marker(TaKaRa，日本)；Agarose Regular(TaKaRa，日本)；30%過氧化氫(北京博艾遠(yuǎn)上生物科技有限公司)。

1.2　種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

1.2.1實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)置HHCB濃度為0、5、10、25、50 mg·L-1[28]，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行。全部實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌條件下操作。實(shí)驗(yàn)前，每個(gè)培養(yǎng)皿放置25粒飽滿、均勻的蘿卜(Raphanus sativus L.)種子(購(gòu)自于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)種子站)，用3%過氧化氫溶液消毒5 min，以避免微生物等原因?qū)ΨN子萌發(fā)的影響；再用ddH2O沖洗3次，以清除殘留過氧化氫。在無(wú)菌培養(yǎng)皿中平整地放入2層濾紙，分別加入5 mL不同濃度的經(jīng)超聲震蕩制備均勻的HHCB懸濁液，并用封口膜沿皿壁密封，以防止HHCB的快速揮發(fā)及保持相對(duì)一致的呼吸和無(wú)菌環(huán)境。將培養(yǎng)皿放置在(25 ± 1) ℃的光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d，對(duì)芽長(zhǎng)大于2 mm的蘿卜幼苗進(jìn)行計(jì)數(shù)及根長(zhǎng)與芽長(zhǎng)的測(cè)量，并計(jì)算各處理組種子發(fā)芽率、根伸長(zhǎng)抑制率和芽伸長(zhǎng)抑制率。

1.2.2數(shù)據(jù)分析

發(fā)芽率計(jì)算：發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù) × 100%

根伸長(zhǎng)(或芽伸長(zhǎng))抑制率計(jì)算：抑制率=(1-處理/對(duì)照) × 100%

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0進(jìn)行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用單因素方差分析中的 LSD多重比較檢驗(yàn)不同處理間的結(jié)果差異顯著性：P < 0.05為差異顯著，P < 0.01為差異顯著。

1.3　DNA損傷實(shí)驗(yàn)

1.3.1實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)與處理同1.2.1，將相同處理的蘿卜幼苗根尖(1～2 cm)進(jìn)行混合，按照試劑盒說明書提取幼苗全基因組DNA，所得DNA用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)其純度及含量，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，上樣100 ng DNA進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，并用DL2000 DNA Marker進(jìn)行含量校準(zhǔn)，再進(jìn)行分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照Liu等[20-21]方法進(jìn)行RAPD分析，對(duì)PCR條件略做優(yōu)化，從GC含量較高(50%～60%)，一般為9～10個(gè)寡核苷酸的12條隨機(jī)引物中篩選出4條能夠獲得清晰條帶，重復(fù)性好的引物P3、P9、P10、P11(表2)。隨機(jī)引物擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)如下：2.5 μL 10 × PCR Buffer，0.2 mmol·L-1dNTP Mixture，1 U LA Taq DNA聚合酶，0.5 μmol·L-1引物，80 ng DNA模板，并用ddH2O補(bǔ)足體系。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s，38 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)3～4個(gè)重復(fù)，并取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以驗(yàn)證RAPD可重復(fù)性。再將驗(yàn)證結(jié)果良好的PCR產(chǎn)物用5%半變性聚丙烯酰氨凝膠(含50%尿素)電泳檢驗(yàn)，銀染顯色并拍照記錄電泳結(jié)果。

1.3.2數(shù)據(jù)分析

電泳圖譜使用Image Lab(Bio-Rad)軟件對(duì)重復(fù)性好的條帶(包括亮帶和可識(shí)別的暗帶)進(jìn)行分析，每一個(gè)條帶為一個(gè)標(biāo)記，代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)各個(gè)分子標(biāo)記的遷移率及其有無(wú)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，若有條帶(包括清晰條帶、可識(shí)別弱帶)出現(xiàn)記作“1”，同一位置沒有條帶記為“0”。應(yīng)用Microsoft Excel 2010建立各引物不同濃度間的“0、1”數(shù)據(jù)庫(kù)，統(tǒng)計(jì)不同脅迫濃度下擴(kuò)增出來(lái)的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)。

表1　佳樂麝香(HHCB)的基本理化性質(zhì)Table 1　Physiochemical properties of galaxolide (HHCB)

各引物的多態(tài)性條帶百分率(percentage of polymorphic bands, PPB)計(jì)算：

PPB=(多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)) × 100%

基因組模板穩(wěn)定性(GTS)計(jì)算：GTS= (1-a/n) × 100%。式中，a為處理組幼苗根尖的RAPD多態(tài)性條帶數(shù)；n為對(duì)照組的總條帶數(shù)。多態(tài)性條帶數(shù)為與對(duì)照組相比，處理組出現(xiàn)的和消失的PCR條帶數(shù)的總和[29]。

用NTSYS 2.10軟件計(jì)算遺傳相似性系數(shù)(Genetic similarity，GS)，采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建遺傳相關(guān)聚類圖。

圖1　HHCB對(duì)蘿卜發(fā)芽率的影響注：字母不相同表示各處理組之間差異顯著(P < 0.05)，下同。Fig. 1　Effects of HHCB on the germination rate of Raphanus sativus L.Note: Values with different letters are significantly different from each other (P < 0.05). The same below.

2　結(jié)果(Results)

2.1　HHCB對(duì)蘿卜種子表觀生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.1.1對(duì)發(fā)芽率的影響

從圖1和圖2A可以看出，當(dāng)HHCB脅迫濃度低于25 mg·L-1時(shí)，蘿卜發(fā)芽未受到顯著影響(P > 0.05)，發(fā)芽率基本維持在86.7%～90.7%；當(dāng)HHCB脅迫濃度達(dá)到50 mg·L-1，甚至更高時(shí)(100 mg·L-1)，蘿卜發(fā)芽受到顯著抑制(P < 0.05)作用，發(fā)芽率分別為56%和28%。這表明蘿卜種子的發(fā)芽率與HHCB脅迫濃度之間存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，HHCB的存在與否及濃度高低能夠?qū)μ}卜種子萌發(fā)產(chǎn)生顯著的生理生化反應(yīng)，最終降低種子萌發(fā)率，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制效果。

表2　RAPD實(shí)驗(yàn)所用隨機(jī)引物序列Table 2　Sequences of 12 primers used in the RAPD experiment

圖2　HHCB對(duì)蘿卜生長(zhǎng)的影響Fig. 2　Effects of HHCB on the growth of Raphanus sativus L.

2.1.2對(duì)蘿卜根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響

從圖2B和圖3可以看出，HHCB對(duì)蘿卜根及芽的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。隨著HHCB的濃度從0增加至100 mg·L-1，蘿卜的根長(zhǎng)從10.15 cm顯著縮短至2 cm以下，芽長(zhǎng)從4.66 cm縮短至1 cm以下。特別是當(dāng)HHCB濃度超過25 mg·L-1時(shí)，蘿卜根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)已不及對(duì)照組的二分之一，根長(zhǎng)分別為1.69 cm和0.61 cm；芽長(zhǎng)分別為1.15 cm和0.34 cm。

圖3　HHCB對(duì)蘿卜根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響Fig. 3　Effects of HHCB on the root and shoot length of Raphanus sativus L.

圖4　HHCB對(duì)蘿卜根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率的影響Fig. 4　Effects of HHCB on the inhibition rates of root and shoot elongation of Raphanus sativus L.

2.1.3對(duì)蘿卜根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率的影響

由圖4可知，HHCB在5～100 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，蘿卜的根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率均隨污染物濃度增加而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。特別是當(dāng)HHCB濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，蘿卜的根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率非常接近，達(dá)93.00%左右?；貧w分析表明(表3)，線性和對(duì)數(shù)方程均可以很好地?cái)M合根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率與HHCB濃度之間的關(guān)系，特別是芽伸長(zhǎng)抑制率與HHCB濃度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(R2=0.91)，可以明顯表征HHCB對(duì)蘿卜的脅迫效應(yīng)。采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件中Probit回歸計(jì)算出HHCB對(duì)蘿卜根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的EC50分別為13.76 mg·L-1和21.66 mg·L-1, 這表明蘿卜根系較芽對(duì)HHCB脅迫更為敏感。

2.2　對(duì)蘿卜幼苗DNA損傷的影響

2.2.1對(duì)根尖基因組DNA含量的影響

提取的蘿卜幼苗根尖全基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰整齊，無(wú)雜質(zhì)污染和降解(圖5)，且A260/A280比值均在1.8～2.0之間，說明提取的DNA質(zhì)量較好，符合RAPD的分析要求。對(duì)不同樣品DNA含量檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，HHCB能夠顯著抑制蘿卜幼苗根尖DNA的產(chǎn)生(圖6)。與對(duì)照組相比，隨著HHCB濃度的增加，DNA含量顯著降低，從116.4 μg·g-1降低至76.38 μg·g-1(50 mg·L-1處理組)；而100 mg·L-1處理組蘿卜發(fā)芽量及根長(zhǎng)量不足，不能進(jìn)行全基因組DNA提取。特別當(dāng)HHCB濃度從0增加至25 mg·L-1，DNA含量基本呈線性降低，此后下降略微緩慢。這表明HHCB的脅迫使蘿卜幼苗根尖基因組DNA發(fā)生斷裂降解，且隨著脅迫濃度的增加，基因組DNA降解程度增加，甚至其合成也受到顯著抑制，使其含量處于較低水平。

表3　HHCB濃度與根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率的擬合方程Table 3　Fitted equations between the concentrations of HHCB and the inhibition rates of root and shoot elongation of Raphanus sativus L.

圖5　蘿卜根尖基因組DNA電泳圖注：M為DL2000 DNA marker；1～5分別表示HHCB的不同脅迫濃度(0、5、10、25、50 mg·L-1)。Fig. 5　Electrophoretogram of the genomic DNA in the seedling roots of Raphanus sativus L.Note: Lane M is DL2000 DNA marker. Lane 1 to 5 represent the different concentrations of HHCB (0, 5, 10, 25 and 50 mg·L-1).

圖6　HHCB對(duì)蘿卜根尖全基因組DNA含量的影響Fig. 6　Effects of HHCB on the contents of the genomic DNA in the seedling roots of Raphanus sativus L.

圖7　蘿卜根尖基因組RAPD電泳圖注：M為DL2000 DNA marker; 1～5分別表示HHCB的不同脅迫濃度(0、5、10、25、50 mg·L-1)；A～D分別表示不同引物 P3、P9、P10、P11。Fig. 7　Electrophoretogram of the genomic RAPD in the seedling roots of Raphanus sativus L.Note: Lane M is DL2000 DNA marker. Lane 1 to 5 represent the different concentrations of HHCB (0, 5, 10, 25 and 50 mg·L-1). Letter A to D represent the primers of P3, P9, P10 and P11.

2.2.2對(duì)根尖基因組DNA損傷的影響

選用4條能夠獲得清晰條帶、重復(fù)性好的RAPD引物對(duì)蘿卜根尖基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從圖7可以看出，4條引物均擴(kuò)增出特異性強(qiáng)且穩(wěn)定性較好的PCR產(chǎn)物。所得擴(kuò)增條帶的相對(duì)分子量集中在500～2 150 bp之間。各處理組蘿卜根尖基因組DNA的RAPD圖譜在數(shù)目、位置及熒光強(qiáng)度上均發(fā)生了明顯的變化，表明在此PCR條件下的擴(kuò)增效果較為理想。利用Image Lab軟件對(duì)RAPD圖譜的條帶數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表4可知，在5 mg·L-1時(shí)，DNA多肽率和基因組模板穩(wěn)定性(GTS)均為對(duì)照的50.0%，即HHCB脅迫導(dǎo)致蘿卜根尖基因組DNA損傷的最低觀察效應(yīng)濃度為5 mg·L-1。由此可見，低濃度的HHCB脅迫就足以對(duì)蘿卜根尖基因組DNA造成嚴(yán)重?fù)p傷，且隨著HHCB處理濃度的增加，DNA多態(tài)率增加，基因組模板穩(wěn)定性(GTS)減小。這些都表明HHCB能夠造成植物嚴(yán)重的DNA損傷，對(duì)基因組的穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。

對(duì)RAPD電泳圖譜進(jìn)行分析，計(jì)算不同處理組間的遺傳相似性系數(shù)，采用UPGMA法構(gòu)建遺傳關(guān)系聚類圖(圖8)。結(jié)果顯示，處理組間的遺傳相似性系數(shù)變化范圍在0.59～0.72之間，遺傳多樣性存在一定的差異。5個(gè)不同濃度處理組在遺傳相似性系數(shù)0.65的位置上可分為3類：對(duì)照組和高濃度組(50 mg·L-1)各為一類，中低濃度組(5、10、25 mg·L-1)歸為一類；而處理組在遺傳相似性系數(shù)0.72的位置上可分為3類：低濃度組(5和10 mg·L-1)為一類，中濃度組(25 mg·L-1)為一類，它們之間的相似性系數(shù)最大為0.72。5和10 mg·L-1處理組間的遺傳相似性系數(shù)高于25和50 mg·L-1處理組間的相似性系數(shù)，表明HHCB的濃度對(duì)受試植物的遺傳多樣性具有顯著影響，隨著化學(xué)品濃度的升高，DNA損傷程度增大，遺傳相似性變遠(yuǎn)。

圖8　不同處理組間聚類分析圖Fig. 8　Dendrogram of cluster analysis for different treatments

處理濃度/(mg·L-1)Treatmentconcentrations/(mg·L-1)條帶數(shù)量NumberofbandsP3P9P10P11條帶總數(shù)Totalbands基因組模板穩(wěn)定性/%GTS/%多肽率/%PPB/%02415302998100.00.051778174950.050.01020711215939.860.22517912236137.862.25022109226335.764.3

3　討論(Discussion)

在以植物作為模式生物的生態(tài)毒理學(xué)評(píng)價(jià)中，經(jīng)常使用較為容易獲得的表觀生長(zhǎng)指標(biāo)，如發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)或生物量等來(lái)考察污染物的生態(tài)毒性效應(yīng)[30]，雖然這可以在一定程度上簡(jiǎn)便、快速地評(píng)價(jià)污染物毒性，但往往也忽略了很多潛在的毒性風(fēng)險(xiǎn)。從本研究中，我們可以清晰地觀察到HHCB在一定濃度范圍內(nèi)(5～25 mg·L-1)對(duì)蘿卜發(fā)芽無(wú)顯著性影響，而陳蘇等[28]的研究顯示，一定濃度的HHCB(50～150 mg·kg-1)對(duì)小麥(Triticum aestivum)發(fā)芽有促進(jìn)作用。研究人員認(rèn)為[28]，這是由于HHCB所具有的類雌激素作用所導(dǎo)致的，低劑量HHCB可以使某些中毒植物細(xì)胞產(chǎn)生興奮效應(yīng)，進(jìn)而在一定程度上刺激植物生長(zhǎng)。雖然污染物同為HHCB且濃度相近，但對(duì)于不同的受試植物，發(fā)芽效應(yīng)所表現(xiàn)出的敏感程度卻不盡相同。此外，我們還發(fā)現(xiàn)HHCB對(duì)蘿卜的根伸長(zhǎng)抑制率明顯高于芽伸長(zhǎng)抑制率，這與范飛等[31]研究麝香酮對(duì)小麥種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)的毒性效應(yīng)結(jié)果一致，即亦顯示麝香酮脅迫小麥的根長(zhǎng)抑制率明顯大于芽長(zhǎng)抑制率。本研究中，蘿卜種子發(fā)芽、根伸長(zhǎng)、芽伸長(zhǎng)對(duì)HHCB的敏感度依次為：根伸長(zhǎng)>芽伸長(zhǎng)>發(fā)芽率，這與Liu等[32]提出的植物種子發(fā)芽相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)的敏感度順序一致，而這一現(xiàn)象可能與種子發(fā)芽和根、芽伸長(zhǎng)的生長(zhǎng)過程有關(guān)。種子發(fā)芽所需能量主要來(lái)自于胚內(nèi)養(yǎng)分的供應(yīng)，所以外源污染物對(duì)種子芽長(zhǎng)的影響在一定濃度下表現(xiàn)得不是很明顯，只有當(dāng)外源污染物達(dá)到一定濃度時(shí)，種子的發(fā)芽過程才會(huì)被抑制。根據(jù)宋玉芳等[33]的研究，小麥種子發(fā)芽對(duì)有機(jī)污染物的敏感度較重金屬?gòu)?qiáng)，而且在根系的受害癥狀與受害機(jī)制上都存在明顯的差異。植物受到重金屬(Cu、Pb、Zn、Cr)脅迫后，僅僅是根伸長(zhǎng)受到抑制，沒有其他明顯的受害癥狀；而本研究中，植物受到新型污染物HHCB脅迫后，不僅根伸長(zhǎng)受到抑制，芽伸長(zhǎng)也受到明顯的抑制。且當(dāng)HHCB濃度較高時(shí)，蘿卜的根和芽均有矮化變粗的現(xiàn)象(圖2)，這與范飛等[31]的研究結(jié)果一致。有研究表明，有機(jī)污染物的生態(tài)毒性不僅與其濃度有關(guān)，還可能與它的其他化學(xué)特性及其對(duì)靶標(biāo)生物的毒性機(jī)制有關(guān)[31]。水培實(shí)驗(yàn)中，蘿卜幼苗的根從一開始就直接浸入到溶液中，其生長(zhǎng)和發(fā)育全過程均通過根系來(lái)直接接觸外源污染，因而根部對(duì)污染物的脅迫響應(yīng)更直接，更敏感。本研究結(jié)果是在水培條件下獲得的，干擾因素相對(duì)較少，更適宜研究單純污染物對(duì)生物的影響；而在土壤環(huán)境中存在諸多能夠影響HHCB化學(xué)性質(zhì)的因素，因此水培實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果更有利于污染物作用機(jī)制的研究，也必然與土培條件下的結(jié)果存在一定差異。

生物基因組DNA是遺傳信息的載體，具有良好的穩(wěn)定性。環(huán)境污染物可以誘導(dǎo)生物體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生DNA損傷和突變，從而導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸增加或缺失，并最終影響DNA片段的圖譜形態(tài)[29]。張義賢等[34]和齊雪梅等[35]的研究均發(fā)現(xiàn)，Cu可造成谷子、大麥和玉米基因組DNA的多態(tài)性增加，增加量與Cu濃度存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。Mengoni等[36]的研究表明，Cu污染可以導(dǎo)致奇異花瓶草(Silene paradoxa L.)RAPD譜帶的增加，且增加的2條譜帶為Cu污染所特有的。解莉婧等[37]、詹振楠等[38]和劉宛等[39]的研究指出，Cd可造成蠶豆(Vicia faba)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)和大麥(Hordeum vulgare)RAPD譜帶的增加、缺失及熒光強(qiáng)度的改變，且基因組模板穩(wěn)定性下降。本研究結(jié)果與上述現(xiàn)象類似，在HHCB脅迫條件下，蘿卜幼苗根尖DNA含量明顯降低，基因組模板穩(wěn)定性下降，且有4條隨機(jī)引物擴(kuò)增得到的RAPD電泳圖譜顯示出明顯的差異，即條帶的減少或增加、熒光強(qiáng)度的減弱或增強(qiáng)。這些都表明HHCB脅迫對(duì)蘿卜造成了非常嚴(yán)重的DNA損傷。而造成蘿卜根尖基因組DNA損傷的可能原因如下：(1)由于基因組重排引起了寡核苷酸引發(fā)位點(diǎn)變化；(2)由于HHCB脅迫誘導(dǎo)了生物體細(xì)胞內(nèi)與引物結(jié)合位點(diǎn)的DNA片段的斷裂、插入、缺失或堿基突變等，使引物無(wú)法與結(jié)合位點(diǎn)匹配，進(jìn)而引起DNA構(gòu)象的改變，呈現(xiàn)出多態(tài)性，形成了新的RAPD電泳圖譜[40-41]；(3)由于在多拷貝引物結(jié)合位點(diǎn)上，某些位置的堿基發(fā)生了突變，導(dǎo)致結(jié)合量增加或減少，擴(kuò)增的DNA量也隨之變化，使RAPD譜帶強(qiáng)度變化[42]，最終導(dǎo)致幼苗根尖基因組模板的穩(wěn)定性下降；(4)幼苗根尖細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶與受損傷的DNA相互作用，這些過程可能會(huì)降低或阻止PCR反應(yīng)中旁路DNA片段的聚合。旁路聚合反應(yīng)是非常復(fù)雜的過程，與DNA聚合酶活性、損傷DNA的結(jié)構(gòu)及其序列等因素有關(guān)[39]。聚類分析結(jié)果表明，不同濃度HHCB處理組間遺傳多樣性存在一定的差異，HHCB的濃度對(duì)受試植物的遺傳多樣性具有一定的影響，且隨著其濃度的升高，DNA損傷程度增大，其遺傳相似性變遠(yuǎn)(圖8)。該結(jié)果與蘿卜幼苗的發(fā)芽生態(tài)毒性指標(biāo)(發(fā)芽率、根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率等)相一致，即HHCB對(duì)蘿卜幼苗生長(zhǎng)的顯著抑制作用與其RAPD電泳圖譜的變化之間存在良好的相關(guān)性，說明幼苗根尖大多數(shù)細(xì)胞中DNA損傷程度可能比較嚴(yán)重，HHCB亦影響基因組模板的穩(wěn)定性。因此，利用RAPD分析植物DNA多態(tài)性變化可作為檢測(cè)HHCB污染的敏感生物標(biāo)記物。

此外，有研究也表明，HHCB污染脅迫能夠引起蚯蚓體內(nèi)活性氧自由基累積、脂質(zhì)過氧化并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷[3]。而細(xì)胞內(nèi)的活性氧若不及時(shí)清除，會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化脅迫，可與蛋白質(zhì)、核酸和脂類作用，進(jìn)而引起DNA損傷、酶失活、膜脂過氧化作用，甚至細(xì)胞死亡[43]。這可能是由于ROS幾乎雜亂地與細(xì)胞內(nèi)的組分發(fā)生反應(yīng)[44]，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，引起DNA斷裂、降解及修飾，從而影響了DNA復(fù)制，進(jìn)而造成DNA損傷。尹冬雪等[45]的研究表明：多環(huán)芳烴(PAHs)對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)的毒害主要是某種自由基的產(chǎn)生引發(fā)了氧化脅迫作用。HHCB是一類典型的疏水性有機(jī)污染物，與多環(huán)芳烴的理化性質(zhì)具有一定的相似性，因此其所引起的毒害效應(yīng)可能與多環(huán)芳烴相似，即HHCB通過對(duì)細(xì)胞造成氧化脅迫作用，進(jìn)而引發(fā)一系列的生理生化毒性效應(yīng)。為了深入探討HHCB的生態(tài)毒性效應(yīng)，有必要在分子水平上進(jìn)一步明確其具體作用機(jī)制，探究在氧化脅迫中占主導(dǎo)因素的自由基類別，及HHCB脅迫誘導(dǎo)蘿卜關(guān)鍵基因的響應(yīng)機(jī)制和產(chǎn)生氧化脅迫的具體過程。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]Balk F, Ford R A. Environmental risk assessment for the polycyclic musks, AHTN and HHCB : II. Effect assessment and risk characterisation [J]. Toxicology Letters, 1999, 111(1-2): 81-94

[2]周啟星, 王美娥, 范飛, 等. 人工合成麝香的環(huán)境污染、生態(tài)行為與毒理效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 28(1): 1-11

Zhou Q X, Wang M E, Fan F, et al. Research progress in environmental pollution, ecological behavior and toxicological effects of synthetic musks [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2008, 28 (1): 1-11 (in Chinese)

[3]陳春, 劉瀟威, 鄭順安, 等. 多環(huán)麝香污染脅迫對(duì)蚯蚓特異性蛋白基因表達(dá)的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 2013, 34(5): 1857-1863

Chen C, Liu X W, Zhen S A, et al. Polycyclic musks exposure affect gene expression of specific protein in earthworm Eisenia fetida [J]. Environmental Science, 2013, 34(5): 1857-1863 (in Chinese)

[4]Sommer C. The role of musk and musk compounds in the fragrance industry [J]. The Handbook of Environmental Chemistry, 2004, 3: 1-16

[5]李卓娜, 周群芳, 劉稷燕, 等. 多環(huán)麝香(PCMs)的環(huán)境行為及毒性效應(yīng)[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2012, 1(4): 606-615

Li Z N, Zhou Q F, Liu J Y, et al. Environmental behavior and toxicological effects of polycyclic musks [J]. Progress in Chemistry, 2012, 1(4): 606-615 (in Chinese)

[6]Api A M, Smith R L, Pipino S, et al. Evaluation of the oral subchronic toxicity of AHTN (7-Acetyl-1,1,3,4,4,6-hexamethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalene) in the rat [J]. Food and Chemical Toxicology, 2004, 42(5): 791-801

[7]Van D B B, Schreurs R, Van D L S, et al. Endocrine effects of polycyclic musks: Do we smell a rat? [J]. International Journal of Andrology, 2008, 31(2): 188-193

[8]郭亞文, 張曉嵐, 錢光人, 等. 城市污泥中合成麝香的分布特征[J]. 環(huán)境科學(xué), 2009, 30(5): 1493-1498

Guo Y W, Zhang X L, Qian G R, et al. Distribution character of synthetic musks in urban sewage sludges [J]. Environmental Science, 2009, 30(5): 1493-1498 (in Chinese)

[9]陳多宏, 胡學(xué)玲, 盛彥清, 等. 典型污水處理廠中多環(huán)麝香的污染特征[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2009, 18(1): 101-105

Chen D H, Hu X L, Sheng Y Q, et al. The pollution character of polycyclic musks in a typical wastewater treatment plant [J]. Ecology and Environment Sciences, 2009, 18(1): 101-105 (in Chinese)

[10]Saraiva M, Cavalheiro J, Lanceleur L, et al. Synthetic musk in seafood products from south Europe using a quick, easy, cheap, effective, rugged and safe extraction method [J]. Food Chemistry, 2016, 200: 330

[11]Williams J G K, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(22): 6531-6535

[12]Welsh J, Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(24): 7213-7218

[13]高揚(yáng), 毛亮, 周培, 等. Cd, Pb污染下植物生長(zhǎng)對(duì)土壤酶活性及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2010, 46(3): 339-345

Gao Y, Mao L, Zhou P, et al. Effect of plant growth on soil enzyme activity and microbe community structure under Cd and Pb stress [J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, 2010, 46(3): 339-345 (in Chinese)

[14]Misra A, Chosdol K, Sarkar C, et al. Alteration of a sequence with homology to human endogenous retrovirus (HERV-K) in primary human glioma: Implications for viral repeat mediated rearrangement [J]. Mutation Research Aundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2001, 484(1-2): 53-59

[15]Garnis C, Rosin M P, Zhang L, et al. Alteration of AKAP220 , an upstream component of the Rb pathway, in oral carcinogenesis [J]. International Journal of Cancer, 2005, 116(5): 813-819

[16]Singh K P, Roy D. Somatic mutations in stilbene estrogen-induced Syrian hamster kidney tumors identified by DNA fingerprinting [J]. Journal of Carcinogenesis, 2004, 3(1): 4

[17]Singh K P, Roy D. Identification of novel breast tumor-specific mutation(s) in the q11.2 region of chromosome 17 by RAPD/AP-PCR fingerprinting [J]. Gene, 2001, 269(1-2): 33-43

[18]Miki Y, Hashiba M, Hisajima S. Establishment of salt stress tolerant rice plants through step up NaCl treatment in vitro [J]. Biologia Plantarum, 2001, 44(3): 391-395

[19]Chao Y E, Feng Y, Yang X E, et al. Effect of long-term stress of high Pb/Zn levels on genomic variation of Sedum alfredii Hance [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2008, 81(5): 445-448

[20]Liu W, Li P J, Qi X M, et al. DNA changes in barley (Hordeum vulgare) seedlings induced by cadmium pollution using RAPD analysis [J]. Chemosphere, 2005, 61(2): 158-167

[21]Liu W, Yang Y S, Li P J, et al. Risk assessment of cadmium-contaminated soil on plant DNA damage using RAPD and physiological indices [J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 161(2-3): 878-883

[22]Liu W, Sun L, Zhong M, et al. Cadmium-induced DNA damage and mutations in Arabidopsis plantlet shoots identified by DNA fingerprinting [J]. Chemosphere, 2012, 89(9): 1048-1055

[23]Gjorgieva D, Kadifkova P T, Ruskovska T, et al. Influence of heavy metal stress on antioxidant status and DNA damage in Urtica dioica [J]. Biomed Research International, 2013, 2013(1): 276-417

[24]Atienzar F A, Jha A N. The random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and related techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: A critical review [J]. Mutation Research Aundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2006, 613(2-3): 76-102

[26]Rong Z, Yin H. A method for genotoxicity detection using random amplified polymorphism DNA with Danio rerio [J]. Ecotoxicology & Environmental Safety, 2004, 58(1): 96-103

[27]范飛. 土壤環(huán)境中人工合成麝香的生態(tài)行為及效應(yīng)研究[D]. 北京：中國(guó)科學(xué)院研究生院, 2008: 11

Fan F. Ecotoxical behavior and effects of synthetical musks in burozem [D]. Beijing: Graduate School of Chinese Academy of Sciences, 2008: 11 (in Chinese)

[28]陳蘇, 孫麗娜, 孫鐵珩, 等. 人工合成麝香對(duì)小麥種子發(fā)芽的生態(tài)毒性[J]. 環(huán)境科學(xué), 2011, 32(5): 1477-1481

Chen S, Sun L N, Sun T H, et al. Ecotoxicity of synthetical musks on wheat (Triticum aestivum) based on seed germination [J]. Environmental Science, 2011, 32(5): 1477-1481 (in Chinese)

[29]Atienzar F A, Cordi B, Donkin M E, et al. Comparison of ultraviolet-induced genotoxicity detected by random amplified polymorphic DNA with chlorophyll fluorescence and growth in a marine macroalgae, Palnaria palnata [J]. Aquatic Toxicology, 2000, 50(1-2): 1-12

[30]范飛, 周啟星, 王美娥. 基于小麥種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)的麝香酮污染毒性效應(yīng)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 19(6): 1396-1400

Fan F, Zhou Q X, Wang M E. Toxic effect of musk ketone based on the determinations of wheat (Triticum aestivum) seed germination and root elongation [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2008, 19(6): 1396-1400 (in Chinese)

[31]張保仁, 崔英, 孟明占. 鎘硒互作對(duì)蘿卜種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響[J]. 濰坊學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 11(6): 68-72

Zhang B R, Cui Y, Meng M Z. Effect of cadmium and selenium on germination and seedling growth of radish seed [J]. Journal of Weifang University, 2011, 11(6): 68-72 (in Chinese)

[32]Liu X, Zhang S, Shan X, et al. Toxicity of arsenate and arsenite on germination, seedling growth and amylolytic activity of wheat [J]. Chemosphere, 2005, 61(2): 293-301

[33]Song Y F, Zhou Q X, Xu H X, et al. Eco-toxicology of heavy metals on the inhibition of seed germination and root elongation of wheat in soils [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2002, 13(4): 459-462

[34]張義賢, 付亞萍, 肖志華, 等. 銅脅迫對(duì)不同基因型谷子幼苗基因組DNA多態(tài)性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 2013, 34(10): 4090-4095

Zhang Y X, Fu Y P, Xiao Z H, et al. Effect of Cu2+stress on DNA polymorpphism of genome in Foxtail millet of different genotypes [J]. Environmental Science, 2013, 34(10): 4090-4095 (in Chinese)

[35]齊雪梅, 李培軍, 劉宛. Cu脅迫對(duì)大麥幼苗生長(zhǎng)及DNA 損傷效應(yīng)的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 27(5): 1925-1928

Qi X M, Li P J, Liu W. Plantlets growth and DNA damage of barley (Hordeum valgare L) under copper stress [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2008, 27(5): 1925-1928 (in Chinese)

[36]Mengoni A, Gonnelli C, Galardi F, et al. Genetic diversity and heavy metal tolerance in population of Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): A random amplified polymorphic DNA analysis [J]. Molecular Ecology, 2000, 9(9): 1319-1324

[37]解莉婧, 劉宛, 李培軍, 等. 隔脅迫對(duì)蠶豆幼苗基因組DNA多態(tài)性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2007, 26(1): 35-39

Xie L J, Liu W, Li P J, et al. Effect of cadmium stress on DNA polymorphism of genome in Vicia faba seedlings [J]. Chinese Journal of Ecology, 2007, 26(1): 35-39 (in Chinese)

[38]詹振楠, 劉宛, 孫梨宗, 等. 鎘脅迫對(duì)擬南芥幼苗基因組DNA 多態(tài)性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 30(6): 1234-1239

Zhan Z N, Liu W, Sun L Z, et al. Effect of cadmium stress on DNA polymorphism of genome in Arabidopsis thaliana seedlings [J]. Chinese Journal of Ecology, 2011, 30(6): 1234-1239 (in Chinese)

[39]劉宛, 鄭樂, 李培軍, 等. 鎘脅迫對(duì)大麥幼苗基因組DNA 多態(tài)性影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 25(1): 19-24

Liu W, Zheng L, Li P J, et al. Effect of cadmium stress on DNA polymorphism of genome in barley seedlings [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2006, 25(1): 19-24(in Chinese)

[40]孫梨宗, 劉宛, 馬珊珊, 等. 鎘誘導(dǎo)擬南芥幼苗DNA損傷[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2012, 31(9): 2337-2343

Sun L Z, Liu W, Ma S S, et al. Cadmium-induced DNA damage of Arabidopsis seedlings [J]. Chinese Journal of Ecology, 2012, 31(9): 2337-2343 (in Chinese)

[41]李慧, 叢郁, 王宏偉, 等. 鎘對(duì)草莓幼苗根尖氧化系統(tǒng)和基因組DNA損傷的影響[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2010, 37(5): 721-730

Li H, Cong Y, Wang H W, et al. Effects of cadmium stress on oxygen enzyme system and genome DNA polymorphism in the root tips of strawberry plants [J]. Acta Horticulturae Sinica, 2010, 37(5): 721-730 (in Chinese)

[42]Jones C, Kortenkamp L. RAPD library fingerprinting of bacterial and human DNA: Applications in mutation detection [J]. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis, 2000, 20(2): 49-63

[43]馬俊旭, 朱大海. 植物超氧化物歧化酶(SOD)的研究進(jìn)展[J]. 遺傳, 2003, 25(2): 225-231

Ma J X, Zhu D H. Functional roles of plant superocide dismutase [J]. Hereditas(Beijing), 2003, 25(2): 225-231 (in Chinese)

[44]Berlett B S, Stadtman E R. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress [J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(33): 20313-20316

[45]尹冬雪, 蘇玉紅, 喬敏. 多環(huán)芳烴芘對(duì)擬南芥的生物毒性效應(yīng)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(23): 818-822

Yin D X, Su Y H, Qiao M. Bio-toxicity effect of polycyclic aromatic hydrocarbons pyrene on Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011, 39(23): 818-822 (in Chinese)