莫凌云，梁麗營，覃禮堂,* ，秦萌，高歡歡

1. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，桂林 541004 2. 桂林理工大學(xué)，廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541004 3. 桂林理工大學(xué)，巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，桂林 541004

在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中，人們和生物體總是同時(shí)暴露于多種污染物中[1-4]。且這些污染物往往呈現(xiàn)多組分水平，并產(chǎn)生協(xié)同、加和、拮抗等毒性相互作用[5-8]。大量混合物毒性研究表明，相互作用濃度比依賴性及效應(yīng)水平依賴性是常見現(xiàn)象[9-10]，這就需要研究混合物在不同濃度配比下的相互作用，并利用合理的、易實(shí)現(xiàn)的方法來對混合物毒性相互作用進(jìn)行表征。

毒性相互作用評價(jià)方法包括：等效線圖、效應(yīng)相加法、毒性指數(shù)法、組合指數(shù)[11]、濃度加和(CA)、獨(dú)立作用(IA)[12]、及模型偏差比(MDR)等。其中，等效線圖、效應(yīng)相加法和毒性指數(shù)法是最早提出的評估方法。而現(xiàn)在對于混合物毒性評估及預(yù)測，使用頻率最高的2個(gè)參考模型為CA和IA模型，其中CA模型適用于具有相似作用模式的混合物體系，而IA模型則適用于具有相異作用模式的混合物體系[13-17]。等效線圖是通過圖形進(jìn)行定性評估，效應(yīng)相加法、毒性指數(shù)法和組合指數(shù)法是通過數(shù)值比較進(jìn)行定性評估；CA和IA可進(jìn)行混合物毒性的定性評估，而模型偏差比(MDR)可進(jìn)行混合物毒性的定量評估。MDR是CA或IA預(yù)測的效應(yīng)濃度與擬實(shí)驗(yàn)濃度的比值，是比較直觀的評估體系[18-19]。通常認(rèn)為，MDR = 1、>1和<1分別表示加和、協(xié)同和拮抗作用。然而，由于實(shí)驗(yàn)誤差等因素可能使該判斷標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)論。例如，MDR = 1.1(或0.9)并不能保證混合物產(chǎn)生協(xié)同作用(拮抗作用)。因此，在此基礎(chǔ)上，采用實(shí)驗(yàn)觀測值的置信區(qū)間(OCI)[20]對毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不確定性進(jìn)行表征更為合理。

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，重金屬和農(nóng)藥在人為或自然因素下的釋放，造成了重金屬和農(nóng)藥在水環(huán)境中普遍共存。由于環(huán)境污染物混合的復(fù)雜性，即使相同化學(xué)物質(zhì)組成的混合物，其混合比例不同或相同濃度配比的不同濃度水平下，也會產(chǎn)生不同的毒性相互作用[21-22]。為了研究農(nóng)藥和重金屬在不同混合比例下的毒性相互作用以及定性和定量表征不同混合比例下的混合物毒性相互作用大小，本研究以費(fèi)氏弧菌為指示生物，測定2種農(nóng)藥(敵敵畏(DIC)、敵百蟲(TRC))和4種重金屬(Ni(NO3)2·6H2O[Ni]、ZnSO4·7H2O[Zn]、CdCl2·2.5H2O[Cd]和K2Cr2O7[Cr])構(gòu)成以等效應(yīng)濃度比混合的混合物毒性，剖析它們的毒性相互作用?；旌衔矬w系包括：農(nóng)藥-農(nóng)藥(DIC-TRC)二元混合、重金屬-重金屬(Ni-Zn-Cd-Cr)四元混合和農(nóng)藥-重金屬(DIC-TRC-Ni-Zn-Cd-Cr)六元混合，應(yīng)用CA和IA對混合物毒性進(jìn)行定性評估，結(jié)合MDR數(shù)值及其95%觀測值置信區(qū)間進(jìn)行定量評估其相互作用大小。

1　材料與方法(Materials and methods)

1.1　主要試劑與儀器

Ni(NO3)2·6H2O[Ni](CAS號13478-00-7，純度≥98.0%)購于廣東光華科技股份有限公司；ZnSO4·7H2O[Zn](CAS號7446-20-0，純度≥99.5%)購于西隴化工股份有限公司；CdCl2·2.5H2O[Cd](CAS號7790-78-5，純度98.0%)購于damas-beta；K2Cr2O7[Cr](CAS號7778-50-9，純度99%)購于damas-beta；農(nóng)藥敵敵畏(DIC)(CAS號62-73-7，純度99.5%)、敵百蟲(TRC)(CAS號52-68-6，純度99%)購于DrEhrenstorfer GmbH公司(德國)。

Synergy 2多功能微孔板檢測儀(美國伯騰儀器有限公司)，YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器(上海醫(yī)用核子儀器廠)，SW-CF-IFD型潔凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(密理博中國有限公司)，Haier藥品保存箱(北京利順航貿(mào)易有限公司)，BT25S型五位電子天平(賽多利斯公司)，WZR-D961型微量型振蕩器(蘇州市東吳醫(yī)用電子儀器廠)，微板選用96 孔平底不透明聚苯乙烯板(Corning9018)，震蕩培養(yǎng)箱(金壇市億通電子有限公司)。

1.2　菌種與培養(yǎng)

費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)凍干粉(購自北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)，液體培養(yǎng)基、固態(tài)培養(yǎng)基配方及細(xì)菌培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)[22]。

1.3　毒性測試及混合物射線設(shè)計(jì)

本研究采用微板毒性分析方法[23]，將加好樣的微孔板放入Synergy 2多功能微孔板檢測儀中，在發(fā)光菌與毒物接觸時(shí)間為15 min時(shí)測定其發(fā)光強(qiáng)度。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高測量精度，在不同時(shí)間、相同條件下，至少進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。發(fā)光抑制率的計(jì)算公式如下：

(1)

式中I0為空白對照RLU的平均值，I為各濃度3次平行樣的RLU平均值。

對于具有一定組成的每個(gè)混合物體系，應(yīng)用等濃度比法設(shè)計(jì)4條混合物射線(EE-NOEC、EE5、EE10和EE50)，同一條射線中某組分的濃度分?jǐn)?shù)或濃度比(pi)即該組分濃度所占混合物總濃度的分?jǐn)?shù)保持不變。2種農(nóng)藥和4種重金屬可構(gòu)成3個(gè)混合物體系為農(nóng)藥二元混合體系(DIC-TRC)、重金屬四元混合體系(Ni-Zn-Cd-Cr)、農(nóng)藥與重金屬六元混合體系(DIC-TRC-Ni-Zn-Cd-Cr)。每組混合物體系設(shè)計(jì)4條混合物射線[24]，共設(shè)計(jì)12條混合物射線，其濃度比例詳見表1。

表1　混合物射線濃度比(pi)及擬合參數(shù)Table 1　Concentration ratios (pi) and fitting parameters of mixture rays

注：EE-NOEC表示單一物質(zhì)的NOEC等效應(yīng)混合；混合物射線EE5、EE10和EE50分別表示單一物質(zhì)的EC5、EC10和EC50等效應(yīng)混合。

Note: EE-NOEC is the mixture designed at the NOEC of single compounds; mixture rays EE5, EE10, and EE50are the mixtures designed at the EC5, EC10, and EC50of single compounds.

1.4　濃度-效應(yīng)曲線擬合

由微板毒性分析方法測定的2種農(nóng)藥和4種重金屬以及它們的混合物濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用Weibull函數(shù)對其進(jìn)行非線性擬合，Weibull函數(shù)見式(2)。

E=1-exp(-exp(α+βlgc))

(2)

式中α和β分別是位置參數(shù)和斜率參數(shù)，E為效應(yīng)即發(fā)光抑制率，c是單一化合物或混合物濃度。模型擬合優(yōu)度采用統(tǒng)計(jì)量均方根誤差(RMSE)和決定系數(shù)(R2)表征，RMSE越小，R2越大，說明擬合效果更顯著。

通過Weibull反函數(shù)，可求得單一化合物或混合物在任意效應(yīng)下的濃度。在混合物體系設(shè)計(jì)中，單一物質(zhì)的EC5、EC10和EC50利用Weibull反函數(shù)計(jì)算。通過Dunnett檢驗(yàn)原理[25]，利用t檢驗(yàn)法比較單一物質(zhì)處理組平均值與實(shí)驗(yàn)空白對照組平均值之間的顯著性差異，決定處理濃度組是否為NOEC。在本文的毒性測試中，每個(gè)毒物由3次重復(fù)的12個(gè)濃度梯度毒物處理組和1個(gè)空白控制組的抑制率數(shù)據(jù)，構(gòu)成Dunnett檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算組間方差、總體方差、組內(nèi)方差、組內(nèi)平均值標(biāo)準(zhǔn)差、毒物處理組與空白之間比較之統(tǒng)計(jì)量tj，比較各處理組統(tǒng)計(jì)量tj與臨界值t(通過查t臨界值表獲得)推算NOEC。NOEC及所有相關(guān)計(jì)算在化學(xué)混合物毒性評估與預(yù)測(APTox)方法體系中完成[26]。

1.5　混合物毒性評估

1.5.1定性評估混合物毒性相互作用

通過CA、IA及其混合物濃度-效應(yīng)曲線95%實(shí)驗(yàn)觀測值的置信區(qū)間(OCI)[20]定性評價(jià)混合物毒性相互作用，當(dāng)CA和IA位于混合物濃度-效應(yīng)95% OCI上限和下限表示加和效應(yīng)，低于95% OCI下限表示協(xié)同作用，高于95% OCI上限表示協(xié)同作用。

CA可以用下面的公式(3)表示[27-28]：

(3)

式中ECx,mix為混合物產(chǎn)生效應(yīng)x時(shí)混合物的濃度(mol·L-1)，ECx,i表示混合物中第i個(gè)化合物單獨(dú)存在時(shí)所產(chǎn)生效應(yīng)x時(shí)的濃度(mol·L-1)，pi為混合物中第i個(gè)組分的濃度占混合物總濃度的比例。

IA可用公式(4)表示[27-28]：

(4)

式中fi為第i個(gè)組分濃度-效應(yīng)函數(shù)，cmix是混合物的總濃度 (mol·L-1)。

混合物濃度-效應(yīng)曲線的95% OCI定義如下[20]：

(5)

式中α為顯著性水平(α=0.05)，t為自由度(n-m)在置信水平為α下的臨界值，自由度(n-m)等于22(36-12-2)，可由t分布表查得(t22,0.025= 207 387)，C為由非線性最小二乘回歸得到的參數(shù)估計(jì)值的協(xié)方差矩陣，s為觀測值標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5.2定量評價(jià)混合物毒性相互作用

為了能夠更加準(zhǔn)確地評估混合物毒性相互作用，通過MDR及其對應(yīng)的95% OCI置信區(qū)間進(jìn)行判斷。MDR定義為某指定效應(yīng)下參考模型CA或IA預(yù)測的效應(yīng)濃度(ECx, PRE)與實(shí)驗(yàn)濃度(ECx, OBS)的比值[29]。

(6)

式中ECx,PRE通過CA或IA計(jì)算，混合物ECx,OBS通過Weibull反函數(shù)計(jì)算。利用95% OCI ECx,OBS的置信區(qū)間上限ECx,上限和下限ECx,下限替代等式(6)中的分子，根據(jù)相對模型偏差比(rMDR)置信區(qū)間的定義[30]，MDR的置信區(qū)間上限(MDR上限)和下限(MDR下限)定義如下：

(7)

(8)

在指定效應(yīng)下，MDR大于MDR上限時(shí)為協(xié)同作用，MDR小于MDR下限時(shí)為拮抗作用，MDR位于MDR上限和MDR下限之間為拮抗作用。

2　結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1　單一重金屬及農(nóng)藥毒性

微板毒性分析法測得4個(gè)重金屬及2個(gè)農(nóng)藥對費(fèi)氏弧菌的濃度-效應(yīng)曲線(CRC)如圖1所示，采用Weibull函數(shù)進(jìn)行擬合得到相關(guān)參數(shù)及NOEC(通過Dunnett檢驗(yàn)獲得)、EC5、EC10與EC50見表2。由圖1和表2可知擬合結(jié)果良好，TRC的毒性(pEC50=2.08)比Cd(pEC50=4.23)的毒性小了2個(gè)數(shù)量級。以pEC50作為標(biāo)準(zhǔn)，其毒性大小順序?yàn)椋篊d > Zn > Ni > Cr> DIC > TRC。

2.2　農(nóng)藥-農(nóng)藥混合毒性

DIC-TRC二元混合物體系各射線的擬合參數(shù)(α和β)及統(tǒng)計(jì)值(R2和RMSE)與pEC50值等列于表1。從表1可以看出，DIC-TRC混合物體系的毒性隨著DIC的濃度降低而有所降低。

各混合物射線對費(fèi)氏弧菌的濃度-效應(yīng)(數(shù)據(jù)點(diǎn))、觀測置信區(qū)間及CA與IA模型曲線結(jié)果列于圖2，混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的CA和IA預(yù)測結(jié)果明顯偏離實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)，呈現(xiàn)明顯的協(xié)同作用。混合物射線EE50在低濃度區(qū)域呈加和作用，高濃度為弱協(xié)同作用，明顯小于混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的協(xié)同作用。因此，這說明同一混合物體系中不同濃度比的混合物射線毒性相互作用不一樣。

圖1　6個(gè)化合物對費(fèi)氏弧菌的劑量-效應(yīng)關(guān)系Fig. 1　Dose-response relationships for 6 compounds to Vibrio fischeri

圖2　農(nóng)藥二元混合物對費(fèi)氏弧菌毒性的CRC及CA和IA預(yù)測結(jié)果注： “·”為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)，“--”表示95%實(shí)驗(yàn)觀測值置信區(qū)間。Fig. 2　The CRCs of acute toxicity of binary mixture of pesticides to Vibrio fischeri and the CA and IA predictionsNote: “·” is the experimental data, “--” is the observation-based confidence interval.

化合物CompoundαβR2RMSE效應(yīng)濃度/(mol·L-1)Effectconcentration/(mol·L-1)NOECEC5EC10EC50EC50置信區(qū)間ConfidenceintervalNi10.373.520.99540.02687.39E-051.62E-042.60E-048.91E-047.74E-04～1.04E-03Zn6.311.730.91520.10001.75E-054.32E-061.13E-051.39E-044.00E-05～3.86E-04Cd10.002.450.99630.02455.44E-065.08E-061.00E-055.87E-054.93E-05～7.14E-05Cr5.171.870.99660.01284.23E-054.44E-051.08E-041.10E-039.82E-04～1.26E-03DIC12.705.900.99830.01811.47E-032.21E-032.92E-036.10E-035.47E-03～7.12E-03TRC2.851.550.99690.01332.23E-041.76E-045.12E-048.41E-037.22E-03～9.58E-03

基于95% OCI的MDR方法定量表征DIC-TRC混合物體系在10%～90%效應(yīng)范圍的相互作用列于圖3。從MDR及其95%OCI隨效應(yīng)x%的變化可知混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10的MDR值均在置信區(qū)間的上方，呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。最大協(xié)同作用發(fā)生在低效應(yīng)和低濃度區(qū)域，隨著效應(yīng)及混合物濃度增加，協(xié)同作用大小逐漸減弱?；旌衔锷渚€EE-NOEC在10%效應(yīng)下的MDRCA和MDRIA分別為58.43和70.24(MDR下限=0.68，MDR上限=1.37)，在50%效應(yīng)下協(xié)同作用大小達(dá)到30.6(MDRCA和MDRIA數(shù)值)。混合物射線EE5、EE10的協(xié)同作用大小接近于混合物射線EE-NOEC。混合物射線EE50的10%效應(yīng)的MDR值位于95%OCI下限和上限，例如在5%效應(yīng)下，混合物MDRCA=1.02和MDRIA=1.08在95% OCI下限(MDR下限=0.47)和上限(MDR上限=1.57)之間，表明混合物在該效應(yīng)下為加和效應(yīng)?；旌衔锷渚€EE50的效應(yīng)大于15%時(shí)CA和IA計(jì)算的MDR值均在置信區(qū)間上限的上方，即混合物發(fā)生協(xié)同作用，且協(xié)同作用最大發(fā)生在40%效應(yīng)下，MDRCA和MDRIA分別為1.96和2.46，均大于95%OCI上限(MDR上限=1.10)。

混合物組分之間的協(xié)同作用與組分濃度、暴露時(shí)間和指示生物等多種因素有關(guān)。對于DIC-TRC二元混合物體系對費(fèi)氏弧菌的急性毒性，相同混合物射線(相同濃度比例)在不同的濃度范圍的協(xié)同作用大小發(fā)生明顯變化，不同濃度比例的混合物射線的協(xié)同作用也不同。因此，混合物濃度及組分的濃度比例是相互作用的主要影響因素之一。

2.3　重金屬-重金屬混合毒性

重金屬Ni-Zn-Cd-Cr四元混合物體系的擬合參數(shù)(α和β)、統(tǒng)計(jì)值(R2和RMSE)、pEC50值及混合物濃度比例等列于表1，從表1可以看出每條混合物射線所含重金屬含量不同，其混合物的毒性沒有明顯差異，pEC50值為3.22～3.46。圖4給出Ni-Zn-Cd-Cr重金屬混合物體系的4條混合物射線對費(fèi)氏弧菌的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)、95%OCI及CA和IA模型預(yù)測結(jié)果。從圖4可以看出3條混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的CA和IA預(yù)測結(jié)果位于95%OCI下限和上限之間，表明混合物為加和效應(yīng)?；旌衔锷渚€EC50的CA和IA預(yù)測結(jié)果在95%置信區(qū)間上限的上方即為拮抗作用。圖5給出四元混合物體系的MDR圖，3條混合物射線EE-NOEC、EE5和EE10的MDR值均在95%OCI下限和上限之間，為加和效應(yīng)?；旌衔锷渚€EE50的MDR值位于95%OCI下限的下方，為拮抗作用?；旌衔锉憩F(xiàn)出拮抗作用則意味著該組混合物中，起決定作用的組分在對費(fèi)氏弧菌致毒過程中出現(xiàn)了不同的毒性效應(yīng)或者類似競爭作用位點(diǎn)的可結(jié)合性的降低，從而減弱了對方的毒性。

圖3　基于CA和IA模型的農(nóng)藥二元混合物MDR值Fig. 3　The MDR value of binary pesticide mixture based on CA and IA models

圖4　重金屬四元混合物對費(fèi)氏弧菌毒性的CRC及CA和IA預(yù)測結(jié)果Fig. 4　The CRCs of acute toxicities of mixtures of four heavy metals to Vibrio fischeri and CA and IA predictions

圖5　重金屬四元聯(lián)合效應(yīng)下CA和IA模型的MDR值Fig. 5　The MDR values of four-component joint effect of heavy metals based on CA and IA models

2.4　農(nóng)藥-重金屬混合毒性

農(nóng)藥-重金屬六元混合物體系的擬合參數(shù)(α和β)、統(tǒng)計(jì)值(R2和RMSE)與pEC50值等列于表2，并將模擬曲線與實(shí)驗(yàn)測定的CRC數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖繪于圖6所示，由CA和IA模型計(jì)算的MDR值如圖7所示。從圖6中可以看出，通過CA與IA定性評估農(nóng)藥-重金屬六元混合物體系的毒性，4條混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10和EE50實(shí)測CRC在整個(gè)濃度區(qū)間均高于CA和IA預(yù)測結(jié)果，呈協(xié)同作用。從圖7中可以看出，4條混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10、EE50的MDR值均在置信區(qū)間上限的上方，呈現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。在50%效應(yīng)下，混合物射線EE-NOEC、EE5、EE10和EE50的MDRCA和MDRIA值分別為4.05和4.91(MDR下限=0.87，MDR上限=1.13)、6.12和7.98(MDR下限=1.42，MDR上限=1.83)、3.70和4.60 (MDR下限=0.88，MDR上限=1.14)、2.62和2.59(MDR下限=0.92，MDR上限=1.09)。因此，該六元混合物體系的協(xié)同作用大小隨著組分濃度變化而變化。出現(xiàn)協(xié)同作用的原因，是由于2種農(nóng)藥與4種重金屬共同存在時(shí)，細(xì)菌的細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，污染物更容易入進(jìn)去到細(xì)胞內(nèi)與酶進(jìn)行反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)光減弱，對細(xì)菌的毒性也就增強(qiáng)[31-32]。

從以上結(jié)果可知，四條DIC-TRC二元混合物射線不同濃度水平對費(fèi)氏弧菌的急性毒性中，除了EC50比混合物射線為弱協(xié)同作用外均有非常顯著的協(xié)同效應(yīng)。四元重金屬混合物體系中，除了混合物射線EE50具有弱的拮抗作用外均為加和作用。在六元農(nóng)藥-重金屬混合物體系中，4條混合物射線均表現(xiàn)出不同的協(xié)同作用，且協(xié)同作用大小在10%～90%效應(yīng)范圍呈現(xiàn)減弱的趨勢，該趨勢與DIC-TRC二元混合物體系的結(jié)果相似。因此，二元混合物(MDRCA和MDRIA大于60)的協(xié)同作用明顯大于六元混合物(MDRCA和MDRIA小于8)。污染物之間的協(xié)同作用與組分濃度配比和混合物濃度密切相關(guān)。

圖6　重金屬與農(nóng)藥六元混合物對費(fèi)氏弧菌急性毒性的CRC及CA和IA預(yù)測結(jié)果Fig. 6　The CRCs of acute toxicities for six components mixtures of heavy metals and pesticides to Vibrio fischeri and CA and IA predictions

圖7　基于CA與IA模型的重金屬與農(nóng)藥六元混合物MDR值Fig. 7　MDR values for six components mixtures of heavy metals and pesticides based on CA and IA

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