楊東麗，楊 瓊，羅 嘉，譚 婭,4，蒲紅州，張順華*，朱 礪*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川成都 6111305；3.四川省南江縣農(nóng)業(yè)局，四川南江 635600；4.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005)

骨骼肌是動物軀體重要的組成部分，也是畜禽生產(chǎn)經(jīng)濟效益的主要部分,占動物體質(zhì)量的40%左右。骨骼肌的生長發(fā)育與動物體健康及產(chǎn)肉動物的生產(chǎn)性能有著密切的聯(lián)系。肌纖維發(fā)育過程首先是中胚層干細胞分化成為成肌細胞(myoblast)，然后成肌細胞融合形成肌管(myotube)，肌管由多個細胞融合形成，因此含有多個核，并且含有肌原纖維，隨著胚胎肌肉的發(fā)育，肌原纖維在肌管細胞內(nèi)逐漸增多，最終發(fā)育形成肌纖維和肌肉組織。動物骨骼肌肌纖維數(shù)目在胚胎發(fā)育期間基本上就已固定，出生后，由于肌纖維的肥大，肌肉表現(xiàn)出增大增粗。骨骼肌的生長發(fā)育是一個非常復(fù)雜的生物學過程，受到多種因素的調(diào)控。

外泌體(exosomes)又稱外泌小體，是一種雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡，直徑 30 nm～100 nm，源于細胞內(nèi)吞系統(tǒng)中的晚期內(nèi)體, 其廣泛存在于各種體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液、精液、乳汁、羊水、腹水、陰道/肺泡灌洗液等[1]。外泌體內(nèi)含豐富的與其來源細胞相關(guān)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA和miRNA等多種生物成分，可以在細胞間進行物質(zhì)和信息傳遞[2-3]。近年來的研究表明，外泌體的功能與其來源細胞或者環(huán)境的性質(zhì)相關(guān)，可以作為一種信息載體對骨骼肌生長發(fā)育及疾病狀況起到重要的調(diào)節(jié)作用。本文就外泌體的發(fā)現(xiàn)及作用，外泌體分離與鑒定方法以及外泌體在骨骼肌生長發(fā)育及相關(guān)疾病中的作用等研究進展進行綜述。

1 外泌體的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用

1.1 外泌體的發(fā)現(xiàn)

1983年P(guān)an B T等[4]發(fā)現(xiàn)羊未成熟紅細胞可以分泌囊泡結(jié)構(gòu)，1987年Johnstone R M等[5]將其命名為外泌體(exosomes)。外泌體在蔗糖溶液中的密度為1.10 g/mL～1.20 g/mL，直徑為30 nm～100 nm。一直以來它們在很大程度上被認為是細胞碎片的傳播者和多余的大分子。直到2007年Valadi H等[2]研究發(fā)現(xiàn),外泌體可作為細胞間基因交流的一種新的機制，可轉(zhuǎn)移功能性RNA分子，包括mRNA和miRNA。這一發(fā)現(xiàn)激起了人們對外泌體領(lǐng)域的興趣。外泌體的產(chǎn)生機制十分復(fù)雜，并且受到多種因子的調(diào)控作用。目前研究者比較認同的機制是:外泌體由細胞在內(nèi)吞時形成的多泡體(multivesicular bodies，MVBs)內(nèi)部產(chǎn)生 ，在胞外分泌的過程中，MVBs包含的腔內(nèi)囊泡(intralumenal vesicles，ILVs) 可以從MVBs的內(nèi)腔釋放到胞外環(huán)境中，這些ILVs就是外泌體[2]。研究表明外泌體存在于各種體液當中，包括血液、尿液、乳汁、胸腔積液、唾液、羊水及腹水等幾乎所有體液中，并且外泌體能被多種活細胞分泌，如間充質(zhì)細胞、脂肪細胞、成纖維細胞、免疫細胞、血小板、成肌細胞和腫瘤細胞[6-9]。

1.2 外泌體的應(yīng)用

外泌體含有表面分子，當其到胞外后能夠有針對性地到達受體細胞，一旦附著至靶細胞，外泌體可以誘導(dǎo)經(jīng)由受體配體相互作用的信號，或者可以通過內(nèi)吞作用和/或吞噬作用與靶細胞膜內(nèi)化，又或與靶細胞融合將其內(nèi)容物遞送到其細胞質(zhì)中，由此改變受體細胞的生理狀態(tài)[10]。大量的研究證實外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原遞呈、腫瘤的生長與遷移、心血管疾病、組織損傷的修復(fù)等[11-12]。因為不同細胞類型分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，所以其可作為疾病診斷的生物標志物，例如Melo S A等[13]發(fā)現(xiàn)細胞表面蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1(glypican 1,GPC1)在胰腺癌個體血液中,外泌體含量特別豐富，GPC1能夠以100%的準確率和敏感性診斷出早期和晚期胰腺癌；Alegre E等[14]研究也發(fā)現(xiàn)外泌體中包含有黑色素瘤標志基因MIA、S100B及腫瘤標志物酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(Tyrp2)存在，并證實了外泌體中的這些標記物的潛在臨床應(yīng)用價值。另外，Ayuko H等[15]研究表明,不同細胞分泌的外泌體擁有不同的整合素類型，從而靶向不同的器官，影響特定器官轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成，這一結(jié)果說明外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，能很好的保護其包被的物質(zhì)，可能成為藥物的天然載體，應(yīng)用于臨床治療。

2 外泌體的分離與鑒定

2.1 外泌體的分離

外泌體的分離純化，常用的方法有差速超速離心法、過濾離心法、密度梯度離心法等，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。隨著研究的深入，外泌體的分離方法也越來越多，免疫磁珠法、色譜法、沉淀試劑盒、差速離心結(jié)合試劑盒、凝膠排阻分離法、膜親和試劑盒等多種手段都可以用來分離不同來源外泌體，并通過它們表面標志物和密度特異性進一步富集[16]。在以上諸多分離方法中，梯度密度離心法是公認的可以得到最高純度的分離方法，但是操作相對復(fù)雜，使用并不廣泛。然而，就目前的分離方法而言，仍沒有一種提取方法能同時保證外泌體的含量、純度以及生物活性，更為關(guān)鍵的是研究者們很難拿到純的外泌體組分，而多是以外泌體為主要組分的胞外微囊泡，所以外泌體分離純化方法和技術(shù)亟待改進和完善。

2.2 外泌體的鑒定

提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學、粒子大小以及標志蛋白等方式實現(xiàn)的。目前可以采用原子力顯微鏡(AFM)、透射電子顯微鏡(TEM)、納米顆粒追蹤分析技術(shù)(NTA)等方法檢測外泌體的形態(tài)大小及分布，外泌體形態(tài)通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形，直徑為30 nm～100 nm[17]。另外，當電鏡圖觀測到的樣品結(jié)構(gòu)不是典型外泌體樣結(jié)構(gòu)時，還需要增加免疫膠體金電鏡進行驗證[17]。對于外泌體標志蛋白的檢測可以采用透射電子顯微鏡(TEM)、流式細胞術(shù)(FMC)、蛋白質(zhì)印跡法(WB)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、質(zhì)譜分析(MS)等對外泌體特定蛋白質(zhì)包括CD9、CD63、 CD81、MHC、Alix、flotillin、TSG101、HSC70等多種外泌體標志蛋白進行鑒定[18]。

3 外泌體與骨骼肌功能調(diào)控

在外泌體發(fā)現(xiàn)的早期，研究者多把研究重點放在外泌體在腫瘤中發(fā)揮的重要作用。很多研究結(jié)果證實了多種促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的細胞因子、生長因子、黏附分子和細胞外基質(zhì)蛋白等以外泌體為載體進入腫瘤細胞微環(huán)境，從而在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及血管生成等過程中發(fā)揮重要作用。近年來，隨著對外泌體研究的深入，已證實外泌體調(diào)控的細胞間信息交流過程也廣泛參與了肌肉的生理及病理過程，并在肌肉生成、肌肉再生、肌肉萎縮等過程中起到不可忽視的作用。

3.1 外泌體與骨骼肌生成

骨骼肌的生成過程主要包括成肌細胞的增殖分化，然后多個成肌細胞融合成多核的肌管，最后肌管進一步發(fā)育成肌纖維和肌肉。成肌細胞是指胞漿中含有肌絲的肌組織前體細胞，具有自我更新和促進肌纖維再生的能力，是體外研究骨骼肌發(fā)育調(diào)控機理的理想載體。2010年Guescini M等[19]第一次發(fā)現(xiàn)成肌細胞可以分泌外泌體，并且在純化的外泌體中檢測到多種蛋白質(zhì)及線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的存在，進一步推測外泌體可能作為mtDNA的載體將其運輸?shù)较噜徎蜻h處的靶細胞，在骨骼肌與其他器官和組織之間的信息交流中發(fā)揮作用。Forterre A等[20]對成肌細胞外泌體(MB exosomes)和肌管外泌體(MT exosomes)進行蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)，在分化過程中肌肉分泌的外泌體攜帶不同的蛋白質(zhì)特異性亞群。肌管外泌體與成肌細胞外泌體相比富含肌肉收縮相關(guān)蛋白，其中包括肌營養(yǎng)不良蛋白關(guān)聯(lián)糖蛋白1(dystrophin associated glycoprotein 1，DAG1)、絲蛋白Cγ(filamin C gamma, FLNC)、肌聯(lián)蛋白(titin，TTN)等。用肌管外泌體孵育成肌細胞發(fā)現(xiàn),其可以抑制成肌細胞增殖促進其分化。為了確定肌管的融合度的增加是否是因為成肌細胞接收了肌管外泌體的內(nèi)含物，F(xiàn)orterre A等[20]用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)陽性的肌管外泌體與非熒光的成肌細胞一起孵育。24 h后在成肌細胞內(nèi)檢測到GFP綠色熒光，進而證實了肌管外泌體可以向成肌細胞傳送其內(nèi)含物。進一步研究結(jié)果顯示,肌管外泌體可以下調(diào)Cyclin-D1和上調(diào)Myogenin進而促進肌纖維的分化。隨后Choi J S等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞在分化過程也可以分泌外泌體，并且證實了其中包含了胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors ，IGFs)、干細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、纖維母細胞生長因子2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF2)和血小板源生長因子AA(platelet-derived growth factor-AA，PDGF-AA)等與肌肉發(fā)育相關(guān)的肌肉生長因子，可以使脂肪間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)成肌化現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)表明外泌體可以通過釋放其內(nèi)含物參與肌細胞間通訊。另外，Aswad H等[22]研究發(fā)現(xiàn)在外泌體耗盡的血清中成肌細胞分化效率降低，這一結(jié)果也表明在肌肉成熟過程中外泌體的重要作用。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們通過結(jié)合mRNA進而參與基因轉(zhuǎn)錄后表達調(diào)控。miRNA在肌肉生長發(fā)育過程中有重要的調(diào)控作用[23]。大量研究表明,多種細胞類型來源的外泌體內(nèi)均攜帶多種mRNA、miRNA，lncRNA，它們在外泌體參與細胞間信息傳遞的作用機制中起到越來越重要的作用。根據(jù)ExoCarta( http://www.exocarta.org/)中的統(tǒng)計[24]，已發(fā)現(xiàn)與外泌體相關(guān)的miRNA有764種，有許多被外泌體攜帶的miRNA已被證實在生物體中發(fā)揮一定的作用。近年來的研究表明,成肌細胞可以分泌外泌體并且可以攜帶miRNA在細胞之間進行信息的傳遞。Forterre A等[20]通過對肌管和成肌細胞外泌體包含的miRNA的分析發(fā)現(xiàn)，肌肉外泌體中包含有170多種miRNA，其中包括miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-206等研究證實,可以調(diào)控肌肉分化的miRNA。為了證明外泌體可以作為miRNA的載體參與肌細胞間通訊，F(xiàn)orterre A等[20]用在C2C12成肌細胞中不能正常表達的秀麗隱桿線蟲miR-238(CaenorhabditiselegansmiR-238，cel-miRNA-238)轉(zhuǎn)染肌管，使其在肌管中表達。用轉(zhuǎn)染后的肌管外泌體孵育后，在成肌細胞中檢測到了cel-miRNA-238，這一結(jié)果表明,肌肉分泌的外泌體可以作為miRNA的載體對其進行物理轉(zhuǎn)移從而參與肌細胞間通訊。進一步試驗結(jié)果顯示，在成肌細胞分化過程中，肌管外泌體攜帶的miRNA會使成肌細胞去乙?；?(Sirtuin 1)表達下調(diào)，進而影響成肌細胞基因的表達以及其分化。有趣的是同樣以成肌細胞為模型進行試驗，萎縮的肌管中miR-23a[25]和miR-182[26]胞內(nèi)表達水平降低，而在其分泌的外泌體中的含量增加。這些試驗表明，肌肉分泌的外泌體可以通過運輸miRNA進而發(fā)揮其調(diào)控作用。除了骨骼肌細胞自身分泌外泌體之外，其他細胞類型來源的外泌體在肌肉生成中也發(fā)揮作用。間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體在體外可以促進肌肉和血管的的生成[27]；乳清蛋白來源的外泌體可以促進肌管中蛋白的合成及其肥大[28]；脂肪分泌的外泌體也可以顯著抑制骨骼肌細胞蛋白激酶B的磷酸化水平[29]。

3.2 外泌體與骨骼肌再生

再生醫(yī)學的策略之一是細胞療法，用于改善受損組織的功能和其再生能力。雖然以細胞為基礎(chǔ)的治療在組織修護方面有明顯的有益效果，但仍存在一些擔憂，如移植細胞生存受限和其再生能力減弱，以及免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。近年來因外泌體病理性和其治療效果多樣性，越來越多的研究表明，外泌體在肌肉損傷中有很大的治療潛能。每種類型的外泌體都有不同的功能，這取決于其來源細胞的功能。最近的研究表明多種有分泌能力的細胞分泌的外泌體都有促進組織再生的潛力。例如，干細胞和祖細胞分泌的外泌體在各種損傷組織中都有很重要的促進修護和再生的作用，包括腎臟[30]、心肌[31]和肝[32]等。與此同時，外泌體在骨骼肌損傷中的作用也逐漸被揭示出來。

骨骼肌損傷之后，炎性細胞和基質(zhì)細胞會分泌一些細胞因子和生長因子，這些自分泌/旁分泌因子不僅可以為成肌細胞和衛(wèi)星細胞的遷移、活化及分化提供有利條件，并且可以平衡肌肉再生和纖維化。研究表明HGF是肌肉干細胞活化及向受損部位轉(zhuǎn)移的強有力的催化劑[33]。肌肉的修護對HGF有劑量的依賴性，并且HGF可以和FGF2、 IGF1、及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等多種成肌因子協(xié)同作用，與單個成肌因子作用相比，可以顯著提高骨骼肌的修護和再生[34]。Choi J S等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，來源于分化期骨骼肌細胞的exosome富含多種成肌因子，其中包括HGF，將其注射到肌肉損傷部位可以顯著減少纖維化面積，增加再生肌纖維的數(shù)量，進而促進骨骼肌的再生。骨骼肌應(yīng)對損傷是一個非常復(fù)雜的過程，會涉及到細胞微環(huán)境和一些有助于肌肉平衡和重塑的因素。Fry C等[35]研究發(fā)現(xiàn)肌肉前體細胞(muscle precursor cells，MPC)與肌肉成纖維細胞共培養(yǎng)使膠原蛋白Col1a2、Col3a1、Col6a2以及纖連蛋白(fibronectin)表達顯著下調(diào)。敲除MPC肌源性miRNA(myo-miRNA)，miR-206，會使調(diào)節(jié)成纖維細胞膠原蛋白生物合成的核糖體結(jié)合蛋白1抗體(Rrbp1)及膠原蛋白表達增加。在體外miR-206在活化的衛(wèi)星細胞(satellite cells)中高表達。用Pax7/DTA小鼠模型，在衛(wèi)星細胞耗盡的情況下機械過載處理后miR-206的表達并未上調(diào)。這和Rrbp1及Col1a2、Col3a1、Col6a2表達上調(diào)相關(guān)。進一步研究表明,MPC釋放的外泌體包含有miR-206，其通過調(diào)節(jié)Rrbp1進而調(diào)節(jié)肌肉成纖維細胞的膠原蛋白的合成，最終調(diào)節(jié)骨骼肌胞外基質(zhì)的沉積及肌肉組織重塑。這個發(fā)現(xiàn)給人們提供了一個新的見解,即：骨骼肌和MPC可以通過外泌體與其他細胞類型相互作用，并進一步活化調(diào)節(jié)肌肉組織修護和再生的胞外環(huán)境。有研究表明，除了骨骼肌細胞自身分泌外泌體之外，其他細胞類型來源的外泌體在骨骼肌再生中也具有一定作用。Nakamura Y等[27]的研究就證明了來源于間充質(zhì)干細胞的外泌體在骨骼肌再生中的重要作用。間充質(zhì)干細胞的外泌體在體外可以促進肌肉和血管的的生成，在體內(nèi)肌肉受損模型中可以促進骨骼肌的再生。盡管間充質(zhì)干細胞分泌的外泌體中包含的與肌肉修護相關(guān)的細胞因子比較少，但是卻鑒別出了與肌肉修護相關(guān)microRNA，其中miR-494起到了部分作用。

3.3 外泌體與肌肉萎縮

骨骼肌萎縮是多種疾病的并發(fā)癥之一，其機制是在病理條件下蛋白質(zhì)降解增加與蛋白質(zhì)的合成受阻而使肌肉變得虛弱的現(xiàn)象，骨骼肌萎縮受到多種因素的調(diào)控。近年來，人們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解增加與肌肉環(huán)狀指基因1(MuRf1)和肌肉萎縮盒F基因(MAFbx,atrogin-1)的表達增加相關(guān)。越來越多的研究表明骨骼肌疾病與多種因素有關(guān)，隨著人們對外泌體各方面研究的深入，其在骨骼肌疾病中發(fā)揮的作用逐漸受到重視。

有研究表明腫瘤分泌的微泡可以誘導(dǎo)骨骼肌細胞的凋亡，因為這種微泡攜帶的miR-21可以通過小鼠成肌細胞的toll樣受體7(TLR7)進行信息傳遞，進而促進細胞的凋亡[36]。叉形頭轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box O3，F(xiàn)OXO3a)可以提高泛素蛋白酶和自噬溶酶體蛋白水解系統(tǒng)成分的表達，在肌肉萎縮中有重要作用。Hudson M B等[26]研究證實,miR-182可靶向作用于FOXO3a，可使包括atrogin-1在內(nèi)的多種FOXO3a靶基因表達受阻。并且發(fā)現(xiàn)，在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)肌管萎縮情況下，肌管分泌的外泌體中miR-182的豐度顯著增加。隨后Hudson M B等[25]同樣以成肌細胞為細胞模型，研究發(fā)現(xiàn)肌管萎縮條件下，miR-23a可以以外泌體為載體，運輸?shù)桨?，降低其胞?nèi)水平，進而使其對靶基因MuRf1和atrogin-1的抑制作用減弱，進而導(dǎo)致肌肉萎縮。這些試驗結(jié)果證實了在肌肉萎縮的情況下，外泌體對miRNA的裝載是一個具有選擇性并且高度監(jiān)管的過程，通過這個機制肌肉細胞可以很快的減少一些特殊的胞內(nèi)miRNA的水平。miR-29a在組織纖維化中起到不可忽視的作用，研究表明，其在缺血預(yù)處理(remote ischemic conditioning，RIC)組織的邊緣或者RIC處理之后肌肉分泌的外泌體中高表達，即使是在分化的成肌細胞分泌的外泌體中，缺氧處理也會使得miR-29a的表達顯著升高[37]。Hu Z等[38]的研究表明，年齡引起的肌肉衰老是因為在這個過程中miR-29被wnt-3a活化，從而使得p85α, IGF-1 and B-myb等信號蛋白的表達受到抑制，進而祖細胞(MPCs)增殖受阻，從而促進肌肉萎縮。在慢性腎臟病(chronic kidney disease，CDK)中，肌肉萎縮是一個嚴重的并發(fā)癥，因為它大大增加發(fā)病率和病死率。Hu Z等[38]證實了CDK抑制miR-29在肌肉中的表達，進一步使得轉(zhuǎn)錄因子YY-1高表達，最終使肌肉的生成受阻。但miR-29是否能夠通過外泌體或者是微泡傳遞進而對肌肉萎縮產(chǎn)生影響還有待進一步的研究。

4 結(jié)語

外泌體的發(fā)現(xiàn)為人們提供進一步了解骨骼肌以及骨骼肌與其他器官之間的細胞間通訊的新視角。外泌體以及以外泌體為運輸載體的microRNA可以調(diào)節(jié)肌肉的發(fā)展、再生及疾病。然而到目前為止，對外泌體復(fù)雜的生物學功能了解有限，準確、高效而標準化的純化方法對于外泌體的后續(xù)研究至關(guān)重要。人們期待著有關(guān)外泌體的生物學研究能夠提供更豐富、更準確的信息, 為進一步充分了解外泌體調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育機制提供重要的理論導(dǎo)向，并應(yīng)用于實際生產(chǎn)中去。

[1] Chevillet J R,Kang Q,Ruf I K,et al.Quantitative and stoichiometric analysis of the microRNA content of exosomes[J].Proceed Nat Acad Sci U S A,2014,111(41):14888-14893.

[2] Valadi H,Ekstr?m K,Bossios A,et al.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells[J].Nature Cell Biol,2007,9(6):654-659.

[3] Zomer A,Maynard C,Verweij F J,et al.Invivoimaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior[J].Cell,2015,161(5):1046-1057.

[4] Pan B T,Johnstone R M.Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytesinvitro:selective externalization of the receptor[J].Cell,1983,33(3):967-978.

[5] Johnstone R M,Adam M,Hammond J R,et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes) [J].J Biol Chem,1987,262(19):9412-9420.

[6] Alnedawi K,Szemraj J,Cierniewski C S.Mast cell-derived exosomes activate endothelial cells to secrete plasminogen activator inhibitor type 1[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005, 25(8):1744-1749.

[7] Buschow S I,van Balkom B W,Aalberts M,et al.MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis[J].Immunol Cell Biol,2010,88(8):851-856.

[8] Yu X,Huang C,Song B,et al.CD4+CD25+regulatory T cells-derived exosomes prolonged kidney allograft survival in a rat model[J].Cell Immunol,2013,285(2):62-68.

[9] Romancino D P,Paterniti G,Campos Y,et al.Identification and characterization of the nano‐sized vesicles released by muscle cells[J].Febs Lett,2013,587(9):1379-1384.

[10] Tkach M,Théry C.Communication by extracellular vesicles:Where we are and where we need to go[J].Cell,2016,164(6):1226-1232.

[11] N?slund T I,Gehrmann U,Qazi K R,et al.Dendritic cell-derived exosomes need to activate both T and B cells to induce antitumor immunity[J].J Immunol,2013,190(6):2712-2719.

[12] Rani S,Ritter T.The exosome A naturally secreted nanoparticle and its application to wound healing[J].Adv Mater,2016,28(27):5542-5552.

[13] Melo S A,Luecke L B,Kahlert C,et al.Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J].Nature,2015,523(7559):177-182.

[14] Alegre E,Zubiri L,Perez-Gracia J L,et al.Circulating melanoma exosomes as diagnostic and prognosis biomarkers[J].Clin Chim Acta,2016,454(67):28-32.

[15] Ayuko H,Bruno C S,Shen T L,et al.Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J].Nature,2016,527(7578):329-335.

[16] Paolini L,Zendrini A,Noto G D,et al.Residual matrix from different separation techniques impacts exosome biological activity[J].Sci Rep,2016,6(3):235-240.

[17] Théry C,Amigorena S,Raposo G,et al.Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids[J].Curr Protoc Cell Biol,2006,3(3):322-329.

[18] Kowal J,Arras G,Colombo M,et al.Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes[J].Proceed Nat Acad Sci U S A,2016,113(8):968-977.

[19] Guescini M,Guidolin D,Vallorani L,et al.C2C12 myoblasts release micro-vesicles containing mtDNA and proteins involved in signal transduction[J].Exp Cell Res,2010,316(12):1977-1984.

[20] Forterre A,Jalabert A,Berger E,et al.Correction:Proteomic analysis of C2C12 myoblast and myotube exosome-like vesicles:A new paradigm for myoblast-myotube cross talk?[J].PLoS One,2014,9(1):84153-84157.

[21] Choi J S,Yoon H I,Lee K S,et al.Exosomes from differentiating human skeletal muscle cells trigger myogenesis of stem cells and provide biochemical cues for skeletal muscle regeneration[J].J Control Relea Offi J Control Relea Soc,2016,222(2):107-113.

[22] Aswad H,Jalabert A.Depleting extracellular vesicles from fetal bovine serum alters proliferation and differentiation of skeletal muscle cells in vitro[J].BMC Biotechnol,2016,16(1):32-38.

[23] Goljanek W K,Sweetman D,Münsterberg A E.microRNAs in skeletal muscle differentiation and disease[J].Clin Sci,2012,123(11):611-625.

[24] Mathivanan S,Fahner C J,Reid G E,et al.ExoCarta 2012:database of exosomal proteins,RNA and lipids[J].Nucl Acid Res,2012,40(3):1241-1244.

[25] Hudson M B,Woodworth M E,Zheng B,et al.miR-23a is decreased during muscle atrophy by a mechanism that includes calcineurin signaling and exosome-mediated export[J].Am J Physiol Cell Physiol,2014,306(6):551-558.

[26] Hudson M B,Rahnert J A,Zheng B,et al.miR-182 attenuates atrophy-related gene expression by targeting FoxO3 in skeletal muscle[J].Ajp Cell Physiol,2014,307(4):314-318.

[27] Nakamura Y,Miyaki S,Ishitobi H,et al.Mesenchymal-stem-cell-derived exosomes accelerate skeletal muscle regeneration[J].Febs Lett,2015,589(11):1257-1265.

[28] Mobley C B,Mumford P W,Mccarthy J J,et al.Whey protein-derived exosomes increase protein synthesis and hypertrophy in C2-C12 myotubes[J].J Dairy Sci,2017,100(1):48-64.

[29] Park S,Zheng D,Barberio M,et al.Adipose-derived exosomes from severely obese individuals regulate skeletal muscle metabolism[J].FASEB J,2016,30(1):1232-1245.

[30] Dorronsoro A,Robbins P D.Regenerating the injured kidney with human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes[J].Stem Cell Res Ther,2013,4(2):1-3.

[31] Ong S G,Wu J C.Exosomes as potential alternatives to stem cell therapy in mediating cardiac regeneration[J].Circulat Res,2015,117(1):7-9.

[32] Tan C Y,Lai R C,Wong W,et al.Mesenchymal stem cell-derived exosomes promote hepatic regeneration in drug-induced liver injury models[J].Stem Cell Res Ther,2014,5(3):1-14.

[33] Turner N J,Badylak S F.Regeneration of skeletal muscle[J].Cell Tissue Res,2012,347(3):759-764.

[34] Braun T,Gautel M.Transcriptional mechanisms regulating skeletal muscle differentiation, growth and homeostasis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2011,12(6):349-361.

[35] Fry C,Kirby T,Kosmac K,et al.Myogenic progenitor cells control extracellular matrix production by fibroblasts during skeletal muscle hypertrophy[J].Cell Stem Cell,2016,20(1):56-61.

[36] He W A,Calore F,Londhe P,et al.Microvesicles containing miRNAs promote muscle cell death in cancer cachexia via TLR7[J].Proceed Nat Acad Sci U S A,2014,111(12):4525-4529.

[37] Yamaguchi T,Izumi Y,Nakamura Y,et al.Repeated remote ischemic conditioning attenuates left ventricular remodeling via exosome-mediated intercellular communication on chronic heart failure after myocardial infarction[J].Int J Cardiol,2015,178(1):239-246.

[38] Hu Z,Klein J D,Mitch W E,et al.MicroRNA-29 induces cellular senescence in aging muscle through multiple signaling pathways[J].Aging,2014,6(3):160-175.