賈章志 徐曉陽 趙秀峰

摘 要：目的 刺激胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的C2C12肌管產(chǎn)生收縮，觀察收縮對其糖代謝的影響。方法 將胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的C2C12肌管分為C組、E組、P組、P+E組。C組和E組用2%BSA無酚紅高糖DMEM孵育，P組和P+E組用濃度0.5 mmol/LPA培養(yǎng)液孵育16h。以15V，30ms，2Hz的強(qiáng)度電刺激E組和P+E組60min，測定細(xì)胞培養(yǎng)液葡萄糖剩余量、總蛋白量、GLUT4細(xì)胞膜蛋白量、AMPK-α2mRNA表達(dá)量。結(jié)果 （1）P組培養(yǎng)液葡萄糖剩余量明顯高于C組，E組培養(yǎng)液葡萄糖剩余量明顯低于C組，P+E組培養(yǎng)液葡萄糖剩余量略高于C組，與P組相比明顯下降。各組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性均無顯著性差異。（2）與C組相比，P組AMPK-α2基因表達(dá)顯著下降，E組明顯升高，60min電刺激后，P+E組AMPK-α2基因表達(dá)較P組明顯提高。（3）P組肌管細(xì)胞膜GLUT4蛋白量、總蛋白量比C組減少。E組肌管細(xì)胞膜GLUT4蛋白量上升，總蛋白量變化不明顯。與P組相比，P+E組肌管細(xì)胞膜GLUT4蛋白量升高，總蛋白無顯著變化。結(jié)論 15V，30ms，2Hz電刺激棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗C2C12肌管60min可以改善胰島素抵抗的狀態(tài)。

關(guān)鍵詞：C2C12 棕櫚酸 胰島素抵抗 電刺激 AMPK-α2 GLUT4

中圖分類號：G80-32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-2813（2018）06（b）-0018-02

電刺激是采用特定頻率、波形和強(qiáng)度的脈沖電流來刺激骨骼肌收縮產(chǎn)生運(yùn)動，主要用于疲勞的恢復(fù)、運(yùn)動損傷的治療、增加肌肉力量等方面。國外研究發(fā)現(xiàn)電刺激肌管能迅速改變骨骼肌細(xì)胞的基因表達(dá)，這些特征都與活體肌肉收縮變化類似。本研究利用電刺激體外培養(yǎng)的肌管收縮，探究收縮對胰島素抵抗肌管的作用。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

小鼠骨骼肌肌母細(xì)胞株（C2C12細(xì)胞）購買于由南方醫(yī)科大學(xué)。

1.2 實驗方案

利用本實驗室前期建立的PA誘導(dǎo)的C2C12胰島素抵抗模型，做電刺激對胰島素抵抗機(jī)制的研究，將肌管饑餓處理12h后分為C組、E組、P組、P+E組。C組和E組用2%BSA無酚紅高糖DMEM孵育，P組和P+E組用濃度0.5mmol/LPA培養(yǎng)液孵育16h，換電刺激液（4mL），以15V，30ms，2Hz的強(qiáng)度電刺激E組和P+E組60min，各組同時收樣，比色法比較C2C12肌管培養(yǎng)液乳酸脫氫酶（LDH）活性，葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測C2C12肌管培養(yǎng)液葡萄糖剩余量，western blot方法測定GLUT4表達(dá)，RT-PCR測試肌管中AMPK-α2mRNA的表達(dá)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)間差異的顯著性用單因素方差分析檢驗，P<0.05即具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。

2 研究結(jié)果

2.1 不同干預(yù)后C2C12肌管培養(yǎng)液糖剩余量、LDH活性的變化

電刺激60min后，E組肌管培養(yǎng)液中葡萄糖剩余量明顯低于C組（P<0.05），P組培養(yǎng)液中的葡萄糖剩余量明顯高于C組（P<0.05），P+E組培養(yǎng)液的葡萄糖剩余量明顯低于P組（P<0.05）。E組、P組、P+E組培養(yǎng)液中LDH活性與C組相比略有升高，但無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 不同干預(yù)后C2C12肌管AMPK-α2 mRNA含量的變化

P組與C組相比AMPK-α2基因表達(dá)顯著下降（P<0.05），E組比C組顯著升高（P<0.05）。電刺激后，P+E組AMPK-α2基因表達(dá)相對P組明顯上升（P<0.05）。

2.3 不同干預(yù)后C2C12肌管GLUT4蛋白表達(dá)

P組肌管細(xì)胞膜GLUT4蛋白量比C組低29.14%（P<0.01），總蛋白低25.42%（P<0.01）。E組細(xì)胞膜GLUT4蛋白量比C組高6.5%（P<0.05），總蛋白量比C組高3.3%，變化不明顯（P>0.05）。與P組相比，P+E組肌管細(xì)胞膜GLUT4蛋白量高22.62%（P<0.01），總蛋白量無明顯變化（P>0.05）。

3 分析與討論

3.1 電刺激強(qiáng)度的確定

本研究使用強(qiáng)度為15V，30ms，2Hz電刺激后，各組LDH活性值各組間無顯著性差異（P>0.05），E組培養(yǎng)液中葡萄糖剩余量明顯低于C組（P<0.05），P+E組培養(yǎng)液中葡萄糖剩余量明顯低于P組（P<0.05）。說明本研究所選用的電刺激強(qiáng)度并沒有造成肌管的大量損傷和死亡，同時促進(jìn)了肌管對于葡萄糖的吸收和代謝。

3.2 電刺激對PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗C2C12肌管糖代謝的影響

研究發(fā)現(xiàn)處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的大鼠骨骼肌細(xì)胞GLUT4mRNA和蛋白表達(dá)都具有缺陷[1]，影響大鼠對糖的攝取和利用，運(yùn)動可以改善大鼠的胰島素抵抗。對分化5天的C2C12肌管進(jìn)行電刺激60min后，培養(yǎng)液中的葡萄糖剩余量與C組相比顯著下降（P<0.05），電刺激引起的收縮可以有效地促進(jìn)肌管對糖的吸收和利用。PA孵育后，肌管培養(yǎng)液中葡萄糖的剩余量高于C組（P<0.05），這說明PA損害了肌管糖吸收和代謝功能。而P+E組肌管的葡萄糖剩余量明顯低于P組（P<0.05），說明電刺激引起的收縮可以改善由PA帶來的胰島素抵抗。

3.3 電刺激對PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗C2C12肌管AMPK-α2 mRNA表達(dá)的影響

60min的電刺激可以引起AMPK-α2表達(dá)的上升（P<0.05），與本實驗室前期的研究結(jié)論一致。P組相對于C組，AMPK-α2表達(dá)明顯下降（P<0.05）。與P組相比，P+E組AMPK-α2表達(dá)得到改善（P<0.05）。在PA誘導(dǎo)產(chǎn)生的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，AMPK-α2的表達(dá)受到嚴(yán)重?fù)p害，而適當(dāng)?shù)碾姶碳t可以改善由于胰島素抵抗造成的AMPK-α2表達(dá)下降的結(jié)果。我們推測收縮可以通過激活A(yù)MPK-α2基因的表達(dá)，提高GLUT4的轉(zhuǎn)位和表達(dá)，促進(jìn)骨骼肌對葡萄糖的吸收和利用。

3.4 電刺激對PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗C2C12肌管GLUT4蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)位的影響

當(dāng)機(jī)體處于胰島素抵抗或2型糖尿病狀態(tài)時，骨骼肌中GLUT4mRNA和GLUT4蛋白表達(dá)明顯低于正常大鼠[1]。通過電刺激肌管，發(fā)現(xiàn)AMPK-α2基因表達(dá)上升，同時GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位明顯增加（P<0.05），總蛋白量也有所上升，與本實驗室的前期研究和大多數(shù)學(xué)者的研究是吻合的。我們可以推測，適宜的電刺激可以通過激活A(yù)MPK-α2基因的表達(dá)，促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)位和表達(dá)，改善細(xì)胞攝取葡萄糖的能力。與C組相比，P組GLUT4膜蛋白量和總蛋白量都明顯下降（P<0.01），這說明在PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，C2C12肌管GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位和表達(dá)明顯下降，嚴(yán)重影響了肌管糖攝取的能力。P+E組與P組相比，GLUT4的膜蛋白量明顯上升（P<0.01），總蛋白量有所上升（P>0.05）。這說明處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的肌管經(jīng)電刺激引起其收縮后，AMPK-α2基因表達(dá)上升，GLUT4的轉(zhuǎn)位和表達(dá)得到改善，電刺激引起的收縮可以通過激活A(yù)MPK-α2基因的表達(dá)，促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)位和表達(dá)，改善由PA孵育誘導(dǎo)的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

4 結(jié)語

15V，30ms，2Hz電刺激棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗C2C12肌管60min可以改善胰島素抵抗的狀態(tài)。

參考文獻(xiàn)

[1] 林強(qiáng).電刺激促進(jìn)2型糖尿病大鼠骨骼肌細(xì)胞葡萄糖運(yùn)載體4轉(zhuǎn)位的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制研究[D].復(fù)旦大學(xué)，2008.