徐宗斌， 張逸羿， 盧星榕， 池 畔

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是臨床最常見的惡性腫瘤之一，在全世界癌癥相關(guān)死亡原因中排第3位[1]。2011年我國CRC的發(fā)病率和病死率分別為23.03/100 000和11.11/100 000，且發(fā)病率較以往明顯升高，多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期[2]。2017年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(national comprehensive cancer network，NCCN)指南推薦，晚期轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)患者采取以手術(shù)為主、化療為輔的綜合治療方案，含有奧沙利鉑(L-OHP)的FOLFOX及CAPOX方案為一線化療方案。然而，采用標(biāo)準(zhǔn)化治療方案的晚期患者5年生存率不足10%[3]，主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗作用，導(dǎo)致L-OHP的應(yīng)用受到較大的限制。目前，針對(duì)L-OHP耐藥的研究仍缺乏有效進(jìn)展，其耐藥機(jī)制仍在探索中。

HOX基因又名Ⅰ型同源異形盒基因，是一類在進(jìn)化上高度保守的基因家族。HOX基因通過調(diào)控凋亡、增殖等參與脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育和器官形成過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，HOX基因表達(dá)的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]。筆者前期研究顯示，在術(shù)前接受含L-OHP化療方案的mCRC患者中，基因芯片發(fā)現(xiàn)響應(yīng)與不響應(yīng)組中HOXB8基因呈現(xiàn)顯著的差異表達(dá)，免疫組織化學(xué)檢測也驗(yàn)證了上述發(fā)現(xiàn)[5-6]。但目前尚無研究顯示，HOXB8在腸癌耐藥細(xì)胞系中是否有相同的差異表達(dá)。因此，本研究擬建立人CRC的L-OHP耐藥細(xì)胞模型，并初步探討HOXB8在耐藥細(xì)胞株的表達(dá)是否存在差異，為進(jìn)一步探索L-OHP的耐藥機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 人CRC細(xì)胞HCT-8(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(廈門鷺隆生物工程材料有限公司)；TRIzol、cDNA合成試劑盒(美國Invitrogen公司)；噻唑藍(lán)(MTT，中國上海華舜生物工程有限公司)；AnnexinⅤ-cy5凋亡和周期檢測試劑盒(美國BD Pharmingen公司)；qPCR擴(kuò)增試劑盒(上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，PCR各引物由上海生工生物公司合成；兔抗人多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein, MRP)、核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross completion gene 1, ERCC1)、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、谷胱甘肽-巰基-轉(zhuǎn)移酶-π(glutathione-s-transferase-π, GST-π)及HOXB8單克隆抗體(美國Abcam公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及HCT-8/L-OHP的建立 癌細(xì)胞株HCT-8培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液中。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1，加入終濃度為2 μmol/L(約1/3 IC50)的L-OHP培養(yǎng)液連續(xù)作用48 h，棄上清液，加入不含L-OHP的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長后，消化傳代，復(fù)用2 μmol/L的L-OHP溶液連續(xù)作用48 h。重復(fù)上述步驟，一個(gè)濃度反復(fù)3～4次，如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高L-OHP的濃度至20 μmol/L，最終獲得能耐受20 μmol/L L-OHP的細(xì)胞株，并將其維持培養(yǎng)在含10 μmol/L L-OHP的完全培養(yǎng)液中，建立人CRC耐藥細(xì)胞株HCT-8/L-OHP，直至細(xì)胞可在含10 μmol/L的 L-OHP培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。對(duì)應(yīng)的野生細(xì)胞進(jìn)行同樣的傳代，但不加藥處理。

1.2.2MTT法檢測各種抗癌藥的細(xì)胞毒作用 取對(duì)數(shù)生長期的HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞，消化離心后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104mL-1。每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，加入倍比稀釋成5種濃度的各種抗癌藥物[L-OHP，5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康(CPT-11)、順鉑(CDDP)及長春新堿(VCR)]各20 μL，每一濃度重復(fù)5孔，并設(shè)置空白對(duì)照和隱形對(duì)照組。培養(yǎng)48 h后，吸去上清液，每孔加無血清培養(yǎng)液200 μL及5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加100 μL的DMSO，置于微量振蕩器上振蕩5 min，在570 nm波長處計(jì)算各組的IC50。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 (1)光鏡觀察：收集HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞,接種至內(nèi)鋪小玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)72 h后，光鏡下觀察、拍照。(2)透射電鏡觀察：收集HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定，繼續(xù)用2%四氧化鋨固定，脫水、包埋、切片和染色，透射電鏡觀察、拍照。

1.2.4細(xì)胞群體倍增時(shí)間和細(xì)胞生長曲線測定 取對(duì)數(shù)生長期的HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞，消化離心，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104mL-1。取2 mL細(xì)胞懸液接種至25 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)。自第1天開始用臺(tái)盼藍(lán)拒染法，以血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，每日取3瓶細(xì)胞，計(jì)算均值，連續(xù)觀察7 d。調(diào)整2種細(xì)胞濃度為5×103mL-1，接種8塊96孔板，每孔200 μL(1×103)，各設(shè)6個(gè)平行孔，每天用MTT法測2種細(xì)胞的吸光值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.5流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡情況 收集HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞，加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇，固定1 h。將等體積的細(xì)胞懸液和PI染液混合，4 ℃下放置30 min。以激發(fā)波長為488 nm測定，并用ModFit LT2.0軟件分析細(xì)胞周期分布。取HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞，均予以20 μmol/L的L-OHP培養(yǎng)液作用48 h，收集培養(yǎng)液以及細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書的操作步驟加入凋亡檢測試劑，檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6檢測HCT-8及HCT-8/L-OHP細(xì)胞株ERCC1，ABCB1，ABCC1，GST-π及HOXB8基因的表達(dá)

1.2.6.1qPCR檢測 TRIzol法提取各組總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃ 60 min→70 ℃ 5 min。產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：94 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s→62 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。采用ΔΔCt相對(duì)定量法分析結(jié)果，差異水平用2-ΔΔCt表示。

ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct管家基因)-對(duì)照組(Ct目的基因-Ct管家基因)

GAPDH(Human)：

F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′

R:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′

ABCC1(MRP or MRP1)：

F:5′-ATCTTGGTCACGCACAGCAT-3′

R:5′-GCATAGGTACGCAGGAACTCA-3′

ABCB1(P-gp)：

F:5′-AACACCACTGGAGCATTGACTAC-3′

R:5′-ATTACAGCAAGCCTGGAACCTAT-3′

GSTP1：

F:5′-ACCGTGGTCTATTTCCCAGTTC-3′

R:5′-AGGTGACGCAGGATGGTATTG-3′

ERCC1：

F:5′-TTTGGCGACGTAATTCCCG-3′

R:5′-TCCGCTGGTTTCTGCTCATAG-3′

HOBX8：

F:5′-CAGACCTACAGCCGCTACCA-3′

R:5′-CGCCGCTTACGAGTCAGATA-3′

1.2.6.2Western-blot檢測 細(xì)胞加入裂解液RIPA(100 μL/106個(gè)細(xì)胞)和1 μL蛋白酶抑制物PMSF，吹打冰浴30 min，4 ℃高速離心15 min，收集上清液。以20～40 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗3次，每次10 min。分別加入ERCC1，ABCB1，ABCC1，GST-π及HOXB8一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入羊抗鼠或羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。用Bio-Rad凝膠成像儀顯影。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用或中位數(shù)表示，并用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)數(shù)資料采用率(或構(gòu)成比)表示，采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié) 果

2.1耐藥細(xì)胞系構(gòu)建成功鑒定

2.1.1成功建立人CRC多藥耐藥細(xì)胞株HCT-8/L-OHP 培養(yǎng)7月后，獲得生長良好的、能耐受20 μmol/L L-OHP的耐藥細(xì)胞株HCT-8/L-OHP，可在含10 μmol/L L-OHP的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。MTT法檢測結(jié)果顯示，親本株對(duì)L-OHP的IC50值為5.78 μmol/L，耐藥株的IC50為62.33 μmol/L、RI為10.78。使用未加L-OHP的培養(yǎng)基培養(yǎng)1月后，測得耐藥株的IC50為56.41 μmol/L，RI為9.75。將HCT-8/L-OHP細(xì)胞凍存，3月后經(jīng)細(xì)胞復(fù)蘇，仍能穩(wěn)定增殖和生長，IC50為58.21 μmol/L，RI為10.07，耐藥性基本保持不變。HCT-8/L-OHP細(xì)胞不僅對(duì)L-OHP產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)另外4種臨床常用的抗癌藥物(5-FU，CPT-11，CDDP及VCR)也產(chǎn)生不同程度的耐藥性，具有多藥耐藥特征(表1)。

表1 HCT-8/L-OHP細(xì)胞的多藥耐藥檢測

FU：5-氟尿嘧啶； CPT-11：伊立替康； CDDP：順鉑； VCR：長春新堿.

2.1.2HCT-8及HCT-8/L-OHP的細(xì)胞形態(tài)

2.1.2.1光鏡觀察 HCT-8細(xì)胞貼壁生長，呈上皮樣單層排列，細(xì)胞大小一致，為圓形或橢圓形，邊界清楚，胞核大而圓，顏色深，胞質(zhì)內(nèi)含顆粒；HCT-8/L-OHP細(xì)胞也呈上皮樣單層排列，但形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞大小不均，細(xì)胞變大，多呈梭形，部分細(xì)胞變圓，折光性變強(qiáng)，核大、色深、不規(guī)則(圖1)。

A：HCT-8細(xì)胞(×100)；B：HCT-8細(xì)胞(×200)；C：HCT-8/L-OHP細(xì)胞(×100)；D：HCT-8/L-OHP細(xì)胞(×200). HCT-8細(xì)胞大小一致，邊界清楚；HCT-8/L-OHP細(xì)胞大小不均，呈梭形，折光性變強(qiáng)，核大、色深、不規(guī)則.圖1 HCT-8和HCT-8/L-OHP光鏡觀察Fig 1 HCT-8 and HCT-8/L-OHP in light microscope

2.1.2.2透射電鏡觀察 HCT-8細(xì)胞核清晰，形態(tài)不規(guī)則，核仁明顯，核內(nèi)可見較多的常染色質(zhì)，未見異染色質(zhì)；線粒體豐富，其結(jié)構(gòu)及板塊嵴清楚完整，細(xì)胞表面微絨毛比較豐富。耐藥株細(xì)胞核大，多見核畸型，染色質(zhì)增多，少量異染色質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)脂滴，線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞表面微絨毛減少、變短(圖2)。

2.1.3細(xì)胞生長曲線的繪制和細(xì)胞群體倍增時(shí)間的檢測 通過MTT實(shí)驗(yàn)繪制生長曲線，HCT-8細(xì)胞：y=0.176 3x-0.052 8，R2=0.990 8；HCT-8/L-OHP細(xì)胞：y=0.056 1x+0.082 1，R2=0.984 4。耐藥細(xì)胞增殖減慢；群體倍增時(shí)間HCT-8和HCT-8/L-OHP分別為28.76和64.57 h(圖3)。

A：HCT-8細(xì)胞(×16 300)； B：HCT-8/L-OHP(×28 000). HCT-8細(xì)胞核清晰，未見異染色質(zhì)；HCT-8/L-OHP核大，多見核畸型，染色質(zhì)增多，少量異染色質(zhì).圖2 HCT-8和HCT-8/L-OHP透射電鏡觀察Fig 2 HCT-8 and HCT-8/L-OHP in electron microscope

HCT-8/L-OHP細(xì)胞增殖較HCT-8減慢，群體倍增時(shí)間延長.圖3 HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞的生長曲線Fig 3 The growth curve of HCT-8 and HCT-8/L-OHP

2.1.4細(xì)胞周期分布和凋亡檢測

2.1.4.1細(xì)胞周期分布 細(xì)胞周期分布分析顯示，HCT-8/L-OHP細(xì)胞在G2/M期所占比例(18.97%)較HCT-8細(xì)胞(4.48%)增多(P<0.01)，同時(shí)在S期(26.43%)及G0/G1期(64.33%)所占比例減少，與HCT-8細(xì)胞比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.1.4.2細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 凋亡情況檢測結(jié)果顯示，HCT-8/L-OHP細(xì)胞早期和晚期凋亡合計(jì)約43.47%，而HCT-8細(xì)胞的凋亡率約75.47%。提示耐藥株的凋亡率明顯低于親本株，二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

Tube001為HCT-8，Tube004為HCT-8/L-OHP.圖4 HCT-8和HCT-8/L-OHP細(xì)胞凋亡情況Fig 4 The apoptosis of HCT-8 and HCT-8/L-OHP

2.2HOXB8以及ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1，ERCC1的mRNA表達(dá)情況 耐藥株HCT-8/L-OHP的ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，ERCC1及HOXB8的mRNA表達(dá)均上調(diào)，與親本株HCT-8比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2，圖5)；而GSTP1 mRNA的表達(dá)二者間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與HCT-8細(xì)胞株比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

與HCT-8細(xì)胞株比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.圖5 各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 5 The relative of indicate gene mRNA expression

2.3HOXB8，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1蛋白表達(dá)情況 Western-blot檢測結(jié)果顯示，HCT-8/L-OHP細(xì)胞的HOXB8，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1蛋白均呈現(xiàn)相對(duì)高表達(dá)，與HCT-8細(xì)胞比較，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

圖6 各基因蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 6 The Western-blot analysis of indicate gend

3 討 論

CRC是臨床最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例數(shù)達(dá)94.5萬例，每年有近50萬人死于CRC[3]。根據(jù)2017年NCCN指南，mCRC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療為姑息化療，其中含L-OHP的FOLFOX及CAPOX方案為一線化療方案，可獲得近50%的緩解率[7]，但仍有近一半的患者對(duì)化療不敏感，且絕大部分初期化療敏感的患者終因腫瘤獲得性耐藥導(dǎo)致化療失敗。因此，尋找腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗的靶點(diǎn)，探索腫瘤細(xì)胞對(duì)化療抵抗的機(jī)制是克服腫瘤細(xì)胞耐藥性、提高化療藥物療效的關(guān)鍵。成功構(gòu)建能夠穩(wěn)定耐藥的細(xì)胞系是研究耐藥的產(chǎn)生、預(yù)防和逆轉(zhuǎn)的重要研究模型[8-10]。

目前，常見的建立耐藥細(xì)胞株方法有以下2種：采用遞增藥物濃度持續(xù)作用和恒定藥物濃度周期作用來進(jìn)行誘導(dǎo)。研究顯示，前者比后者誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥性更強(qiáng)且更穩(wěn)定[11]。本研究采用前者建立耐藥細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞代謝率降低，生物活力減弱，群體倍增時(shí)間是親本細(xì)胞株的2.25倍，說明耐藥細(xì)胞株增殖速度減慢，與張立陽等的研究結(jié)果類似[12]。隨著腫瘤細(xì)胞倍增時(shí)間的延長，細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性降低[13]。從細(xì)胞周期的分布發(fā)現(xiàn)，耐藥株細(xì)胞在G2/M期所占比例增多，提示細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，這與其他研究者所建立的耐藥細(xì)胞株結(jié)果相似[14]。另外，細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞株在相同濃度的L-OHP作用下凋亡率更低，進(jìn)一步佐證了耐藥細(xì)胞株對(duì)L-OHP有更強(qiáng)的抵抗作用。耐藥細(xì)胞株不僅對(duì)L-OHP有抗性，對(duì)5-FU，CPT-11，CDDP及VCR也具有一定抗性，產(chǎn)生多藥耐藥。研究顯示，5-FU及CPT-11在CRC患者體內(nèi)的血藥濃度常維持在30和10 μg/L左右[15-16]。本研究中耐藥細(xì)胞株對(duì)5-FU及CPT-11相對(duì)耐藥可達(dá)1 587.22和40.21 μg/L，可見本研究所建立的耐藥細(xì)胞株可抵抗臨床用藥濃度。

腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的抵抗可能與DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)的過表達(dá)以及蛋白質(zhì)差異表達(dá)相關(guān)，其中核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)過表達(dá)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白過表達(dá)以及GST-π過表達(dá)等可能通過其調(diào)控的基因及其下游事件發(fā)揮相應(yīng)作用[17-19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在耐藥細(xì)胞株中，ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1(P-gp)，GSTP1及ERCC1等常見耐藥基因表達(dá)呈現(xiàn)顯著性的差異上調(diào)。由于在產(chǎn)生對(duì)L-OHP耐藥的同時(shí)，上述機(jī)制的表達(dá)異常引起耐藥細(xì)胞株對(duì)其他藥物產(chǎn)生抵抗，本研究也證實(shí)了該結(jié)果。

HOX基因家族是動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的主控基因，目前有較多的研究證實(shí)，HOX基因表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[20-23]。HOXB8基因是HOX 基因家族的成員之一，位于17p21.3，編碼同源框DNA結(jié)合域的核蛋白，參與細(xì)胞的正常分化、發(fā)育。蘭鴻波等研究顯示，HOXB8的過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)正相關(guān)，并可能通過miR-196調(diào)控，miR-196可能與AKT通路的激活相關(guān)[24-25]。Ding等研究也顯示，HOXB8的過表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移侵襲能力呈正相關(guān)[26]。本課題組在評(píng)估接受含L-OHP方案的CRC患者的療效時(shí)發(fā)現(xiàn)，在響應(yīng)與不響應(yīng)組中，HOXB8基因呈現(xiàn)顯著的差異表達(dá)[5]。本研究成功構(gòu)建L-OHP耐藥細(xì)胞株，并通過qPCR以及Western-blot揭示了HOXB8基因在耐藥細(xì)胞株呈現(xiàn)明顯差異表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)了HOXB8的過表達(dá)可能與L-OHP耐藥相關(guān)，但尚未明確HOXB8通過何種方式調(diào)控耐藥的產(chǎn)生。

本研究成功構(gòu)建了L-OHP耐藥細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其與耐藥蛋白的過表達(dá)、DNA修復(fù)系統(tǒng)的過表達(dá)以及GST-π過表達(dá)相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)HOXB8基因在耐藥株中呈現(xiàn)過表達(dá)，但其參與耐藥機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] Edwards B K, Noone A M, Mariotto A B,etal. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2010, featuring prevalence of comorbidity and impact on survival among persons with lung, colorectal, breast, or prostate cancer[J].Cancer, 2014,120(9):1290-1314.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)政醫(yī)管局, 中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤學(xué)分會(huì). 結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2015年版)[J]. 中華外科雜志, 2015,53(12):881-894.

[3] Weitz J, Koch M, Debus J,etal. Colorectal cancer[J].Lancet, 2005,365(9454):153-165.

[4] Vider B Z, Zimber A, Chastre E,etal. Deregulated expression of homeobox-containing genes, HOXB6, B8, C8, C9, and Cdx-1, in human colon cancer cell lines[J].BiochemBiophysResCommun, 2000,272(2):513-518.

[5] Li S, Lu X, Chi P,etal. Identification of HOXB8 and KLK11 expression levels as potential biomarkers to predict the effects of FOLFOX4 chemotherapy[J].FutureOncol, 2013,9(5):727-736.

[6] Shen S, Pan J, Lu X,etal. Role of miR-196 and its target gene HoxB8 in the development and proliferation of human colorectal cancer and the impact of neoadjuvant chemotherapy with FOLFOX4 on their expression[J].OncolLett, 2016,12(5):4041-4047.

[7] Goldberg R M, Sargent D J, Morton R F,etal. A randomized controlled trial of fluorouracil plus leucovorin, irinotecan, and oxaliplatin combinations in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer[J].JClinOncol, 2004,22(1):23-30.

[8] Zhang X, Xiao W, Wang L,etal. Deactivation of signal transducer and activator of transcription 3 reverses chemotherapeutics resistance of leukemia cells via down-regulating P-gp[J].PLoSOne, 2011,6(6):e20965.

[9] Yun M, Lee D, Park M N,etal. Cinnamaldehyde derivative (CB-PIC) sensitizes chemo-resistant cancer cells to drug-induced apoptosis via suppression of MDR1 and its upstream STAT3 and AKT signalling[J].CellPhysiolBiochem,2015,35(5):1821-1830.

[10] Rad S M, Langroudi L, Kouhkan F,etal. Transcription factor decoy: a pre-transcriptional approach for gene downregulation purpose in cancer[J].TumourBiol, 2015,36(7):4871-4881.

[11] 王開雷, 李樂平, 靖昌慶. 兩種人大腸癌多藥耐藥株的建立及耐藥性比較[J]. 山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2011,49(4):75-79.

[12] 張立陽, 趙玉沛, 吳元德, 等. 胰腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株SW1990/ADM的建立及其耐藥機(jī)理研究[J]. 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2005,12(1):46-50.

[13] 錢 靜, 陳不尤, 劉賢稱, 等. 人肺腺癌厄洛替尼耐藥細(xì)胞系PC-9/ER的建立及其特性[J]. 臨床與病理雜志, 2015,35(6):1080-1086.

[14] Smith V, Rowlands M G, Barrie E,etal. Establishment and characterization of acquired resistance to the farnesyl protein transferase inhibitor R115777 in a human colon cancer cell line[J].ClinCancerRes, 2002,8(6):2002-2009.

[15] 宋衛(wèi)峰, 王 雷, 蔡 訊, 等. 晚期結(jié)直腸癌患者氟尿嘧啶劑量與血藥濃度和生存的關(guān)系[J]. 腫瘤, 2013,33(9):820-826.

[16] 鞠曉宇, 羅雪梅, 葛衛(wèi)紅, 等. 高效液相色譜法測定血中伊立替康及活性代謝物SN-38濃度[J]. 藥學(xué)與臨床研究, 2015,23(3):267-270.

[17] Cohen R, Cervera P, Svrcek M,etal. DNA mismatch repair and BRAF status in colorectal cancer: Interest for the therapeutic management[J]?BullCancer, 2015,102(6 Suppl 1):72-81.

[18] Redmond K M, Wilson T R, Johnston P G,etal. Resistance mechanisms to cancer chemotherapy[J].FrontBiosci, 2008,13:5138-5154.

[19] Noda E, Maeda K, Inoue T,etal. Predictive value of expression of ERCC 1 and GST-p for 5-fluorouracil/oxaliplatin chemotherapy in advanced colorectal cancer[J].Hepatogastroenterology, 2012,59(113):130-133.

[20] Cillo C, Barba P, Freschi G,etal. HOX gene expression in normal and neoplastic human kidney[J].IntJCancer, 1992,51(6):892-897.

[21] Miller G J, Miller H L, van Bokhoven A,etal. Aberrant HOXC expression accompanies the malignant phenotype in human prostate[J].CancerRes, 2003,63(18):5879-5888.

[22] López R, Garrido E, Vázquez G,etal. A subgroup of HOX Abd-B gene is differentially expressed in cervical cancer[J].IntJGynecolCancer, 2006,16(3):1289-1296.

[23] De Vita G, Barba P, Odartchenko N,etal. Expression of homeobox-containing genes in primary and metastatic colorectal cancer[J].EurJCancer, 1993,29A(6):887-893.

[24] 蘭鴻波, 潘 杰, 盧星榕, 等. miR-196b mRNA和HoxB8 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2013,20(4):400-405.

[25] Schimanski C C, Frerichs K, Rahman F,etal. High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells[J].WorldJGastroenterol, 2009,15(17):2089-2096.

[26] Ding W J, Zhou M, Chen M M,etal. HOXB8 promotes tumor metastasis and the epithelial-mesenchymal transition via ZEB2 targets in gastric cancer[J].JCancerResClinOncol, 2017,143(3):385-397.