馬躍飛， 歐啟水， 湯紹鵬， 王炳龍， 林錦驃， 楊 濱

Sysmex XS-800i全自動血細(xì)胞分析儀具有故障率低、噪音低、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡單等特點，并且檢測成本適中，適合于大、中、小型的醫(yī)療單位使用。因其可進(jìn)行微量血液檢測(僅需20 μL)，更加適用于小兒科、化療科等采血相對困難的人群。Sysmex XS-800i儀器計數(shù)血小板(platelet，PLT)聯(lián)合應(yīng)用電阻抗法和浮動界標(biāo)技術(shù)，即根據(jù)紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)和PLT因體積大小不同所致分布曲線的差別，用微積分方法計算兩者交界處的最低點，作為PLT和RBC的分界線，一般在10～35 fL。小于此分界線的血細(xì)胞數(shù)量即為PLT數(shù)。但是，電阻抗法本身無法完全排除非PLT顆粒(如細(xì)胞碎片、細(xì)菌、真菌等)的干擾[1-2]。筆者科室的Sysmex XS-800i儀主要用于兒科患者末梢血標(biāo)本的檢測，自使用以來已經(jīng)建立了完善的復(fù)檢規(guī)則。但隨著設(shè)備使用時間增長，儀器報警增多，PLT計數(shù)的假陰性率有增高趨勢。為保證PLT計數(shù)的準(zhǔn)確性，依據(jù)ISO 15189《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》的要求[3]，筆者科室對Sysmex XS-800i儀檢測PLT的性能和影響因素重新進(jìn)行全面評估，以期為修訂該儀器的PLT復(fù)檢規(guī)則提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本 收集2017年3-5月在筆者醫(yī)院兒科就診患兒的末梢及靜脈血液標(biāo)本共498例。所有受檢標(biāo)本用EDTA-K2抗凝，充分混勻防止凝固，2 h內(nèi)完成檢測。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1儀器 全自動血細(xì)胞分析儀(Sysmex XS-800i，日本希森美康公司)；全自動血細(xì)胞分析儀(ADVIA 2120i，德國西門子公司)；OLYMPUS普通光學(xué)顯微鏡(CX31，日本奧林帕斯公司)；改良牛鮑計數(shù)板、EDTA-K2真空負(fù)壓采血管(批號：OTD6O26，福州長庚醫(yī)療器械公司)；微量采血管(批號：V29S518E5，美國MEDLANCE公司)。

1.2.2試劑 Sysmex XS-800i檢測試劑：CELLPACK稀釋液(批號：G 6459)，低值質(zhì)控品(批號：70780810)，中值質(zhì)控品(批號：70780811)，高值質(zhì)控品(批號：70780812)，均為希森美康公司。ADVIA 2120i檢測試劑：RBC/PLT計數(shù)(批號：90995)，SHEATH/RINCE(批號：0247)，中值質(zhì)控品(批號：TP 72035)，高值質(zhì)控品(批號：TP 73035)，均為德國西門子公司。1%草酸銨稀釋液(PLT稀釋液)參照文獻(xiàn)[4]的要求配置，4 ℃保存。Baso瑞氏吉姆薩染色液(批號：416092，珠海貝索公司)。

1.3PLT 測定方法

1.3.1儀器計數(shù)法

1.3.1.1阻抗法(PLT-I) 按照Sysmex XS-800i的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。操作前參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行校準(zhǔn)，確保儀器正常運行。運行質(zhì)控在控，試劑無過期變質(zhì)現(xiàn)象。記錄PLT計數(shù)結(jié)果，觀察直方圖，記錄相關(guān)報警(如PLT直方圖異常、PLT聚集、RBC碎片、小RBC等)。

1.3.1.2光學(xué)法(PLT-O)二維激光法 按照ADVIA 2120i的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程操作。操作前確保儀器正常運行。運行質(zhì)控在控，試劑無過期變質(zhì)現(xiàn)象。記錄PLT計數(shù)結(jié)果。

1.3.2顯微鏡計數(shù)法(PLT-M) 參照文獻(xiàn)[4]操作。由2名技術(shù)熟練的技師采用雙盲法進(jìn)行顯微鏡下PLT的計數(shù)，取2人計數(shù)平均值。2人計數(shù)差別較大時，則由第3人計數(shù)。取3次結(jié)果中相近的2次均值作為顯微鏡檢計數(shù)值。

1.3.3鏡檢估值法 取標(biāo)本5 μL，制成血涂片，進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色。正常情況下在血片厚薄適中區(qū)域(RBC散開，互相接觸但不重疊，相鄰RBC的距離不超過1個RBC)，每個油鏡視野約有8～15個PLT，或每10～30個RBC中見到1個PLT。油鏡下計數(shù)11個視野的PLT總數(shù)各2次，取平均值。此法作為PLT過高或過低時，顯微鏡計數(shù)法的補(bǔ)充方法，同時作為PLT聚集和大PLT驗證及篩查方法。

1.4性能評價 參照文獻(xiàn)[6]執(zhí)行。

1.4.3線性實驗 將相同血型，PLT高值(>900×109L-1)、低值(<30×109L-1)兩份靜脈血標(biāo)本按5∶1，4∶2，3∶3，2∶4及1∶5的比例配制成系列濃度，加上原標(biāo)本，共7個標(biāo)本，每個標(biāo)本重復(fù)檢測3次取平均值，以計算理論值為x軸，實際測試值為y軸，做線性回歸分析。

1.4.4攜帶污染率 取1份PLT高值(PLT>900×109L-1)標(biāo)本連續(xù)測定3次(H1，H2，H3)，再取1份PLT低值(PLT<30×109L-1)標(biāo)本連續(xù)測定3次(L1，L2，L3)，用公式(L1-L3)/(H1-L3)×100%計算攜帶污染率。

1.4.5正確度驗證 取一定濃度范圍內(nèi)10份新鮮末梢血液標(biāo)本，在Sysmex XS-800i和ADVIA 2120i上同時檢測PLT，以參加室間質(zhì)評的ADVIA 2120i為基準(zhǔn)儀器，計算偏倚，偏倚應(yīng)≤12.5%。若PLT<40×109L-1，偏倚應(yīng)≤15.0%。80%以上符合為正確度驗證合格。

1.4.6低值PLT一致性驗證 選取20例PLT低值(<55×109L-1)末梢血標(biāo)本，涂片染色后鏡下觀察無大PLT、小RBC/RBC碎片干擾，無PLT聚集等干擾現(xiàn)象。分別用Sysmex XS-800i分析儀、ADVIA 2120i分析儀和顯微鏡檢法計數(shù)PLT。以鏡檢法為參考方法，通過線性回歸分析血液分析儀與鏡檢法的一致性。

1.5影響因素評價

1.5.1小RBC干擾評價 分為2組實驗。

第1組實驗選取PLT直方圖正常、無大PLT且平均紅細(xì)胞體積(mean corpuscular volume，MCV)<80 fL的末梢血標(biāo)本90例。為了提供更精確的復(fù)檢規(guī)則依據(jù)，本組中以80，75和70為節(jié)點分成3小組，即75 fL

第2組實驗選取PLT直方圖異常(峰高降低、右側(cè)不平滑且不與橫坐標(biāo)相切、峰底變寬、翹尾等現(xiàn)象，或儀器有報警提示)、無大PLT且MCV<80 fL末梢血標(biāo)本120例，因本實驗室目前建立的復(fù)檢規(guī)則為“MCV<65 fL時需鏡檢”，為了驗證和細(xì)化該規(guī)則，本組按75 fL

1.6儀器報警有效性驗證實驗 影響PLT計數(shù)的報警類型主要為“小RBC”、“RBC大小不一”、“大PLT”“PLT分布異常”及“PLT聚集”。選取含上述報警和無報警的末梢血標(biāo)本共189例進(jìn)行人工涂片鏡檢。分別計算各儀器報警的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 17.0軟件及Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對各組間差別性比較采用配對t或獨立樣本t檢驗，P<0.05為差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1精密度分析 低、中、高值日內(nèi)和批間精密度分別為4.27%，1.39%，1.15%和4.09%，1.38%，1.90%，均在可接受精密度范圍內(nèi)(≤5.0%)(表1)。

表1 精密度實驗結(jié)果

2.2線性分析 對高、低值標(biāo)本進(jìn)行等濃度梯度稀釋后，以理論計算值為x軸，實際測試值為y軸，回歸方程為y=1.001x+6.163，r=0.999 5，實際測量值與理論計算值相關(guān)性良好，表明儀器在廠家提供的測量范圍內(nèi)線性良好(圖1)。

圖1 線性分析結(jié)果Fig 1 Results of linearity experiment

2.3攜帶污染率 PLT高值分別為H1：962×109L-1，H2：971×109L-1，H3：971×109L-1。低值分別為L1：22×109L-1，L2：21×109L-1，L3：21×109L-1。攜帶污染率為0.11%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求(≤4.0%)。

2.4正確度驗證 在測量范圍內(nèi)，Sysmex XS-800i與參加室間質(zhì)評的西門子ADVIA 2120i的檢測符合率達(dá)90%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求(表2)。

2.5低值PLT一致性評價 對于低值范圍內(nèi)的PLT(11×109～55×109L-1)，兩臺儀器檢測與鏡檢法的一致性均良好，Sysmex XS-800i分析儀回歸方程：y=8.575×10-1x+ 0.530 3，r=0.923 9。ADVIA 2120i分析儀回歸方程y=8.746×10-1x+3.878，r=0.908 0。數(shù)據(jù)提示Sysmex XS-800i對11×109～55×109L-1范圍內(nèi)的低值PLT的準(zhǔn)確性良好，略優(yōu)于ADVIA 2120i(圖2，3)。

2.6小RBC干擾評價 PLT直方圖正常組與人工顯微鏡檢計數(shù)相比，MCV<70 fL時儀器計數(shù)結(jié)果差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)；PLT直方圖異常組MCV<75 fL時，各實驗組儀器檢測結(jié)果差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.043，0.003，0.000)(表3)。

表2 正確度驗證實驗結(jié)果

圖2 Sysmex XS-800i與鏡檢法的低值PLT檢測一致性Fig 2 Correlation of Sysmex XS-800i with manual microscopy for low-value PLT count

圖3 ADVIA2120i與鏡檢法的低值PLT檢測一致性Fig 3 Correlation of ADVIA2120i with manual microscopy for low-value PLT count

Tab3Comparation of PLT count between Sysmex XS-800i and manual microscopy in different small RBC groups

組別n儀器計數(shù)人工鏡檢直方圖正常75fL

MCV：平均紅細(xì)胞體積. 與人工鏡檢比較，△：P<0.05.

表4不同大血小板組儀器與顯微鏡檢血小板計數(shù)結(jié)果比較

Tab4Comparation of PLT count between Sysmex XS-800i and manual microscopy in different large PLT groups

組別n儀器計數(shù)人工鏡檢MPV>x+s20231±99238±103MPV>x+2s20262±144△275±149MPV>x+3s20207±121△224±131

MPV：平均血小板體積. 人工鏡檢比較，△：P<0.05.

2.8儀器報警有效性驗證 影響儀器計數(shù)PLT的報警有效性驗證結(jié)果如表5所示。各報警的敏感性、陰性預(yù)測值均較好。特異性較高的報警為“RBC大小不一”和“小RBC”，較差的是“PLT聚集”。陽性預(yù)測值最高的報警為“RBC大小不一”，較低的是“PLT聚集”和“大PLT”。

表5 影響血小板計數(shù)的相關(guān)報警有效性驗證結(jié)果

3 討 論

多數(shù)醫(yī)院使用全自動血液分析儀計數(shù)PLT。性能優(yōu)越、穩(wěn)定的儀器可以大大提高工作效率，緩解人力壓力。但是，儀器計數(shù)只是“篩選”手段，各單位應(yīng)全面了解儀器的檢測性能，定期進(jìn)行性能驗證和評估[4]，建立適用的人工鏡檢規(guī)則，以保證儀器計數(shù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[7-9]。

本研究顯示，PLT檢測的精密度、攜帶污染率、線性、正確度均符合要求，提示Sysmex XS-800i儀檢測PLT性能良好，結(jié)果可靠。低值PLT檢測的準(zhǔn)確性對于血液病診斷、輸血意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，對于低值PLT的檢測，PLT-I和PLT-O檢測的不精密度均較高[10]。本研究中，Sysmex XS-800i儀檢測低值標(biāo)本的不精密度高于中、高值標(biāo)本。筆者還對低值標(biāo)本儀器與人工的檢測一致性進(jìn)行了初步評估，研究發(fā)現(xiàn)在選取的PLT低值區(qū)間(11×109～55×109L-1)，Sysmex XS-800i儀與鏡檢計數(shù)法的一致性良好，r=0.923 9，略優(yōu)于使用光學(xué)法(PLT-O)的ADVIA 2120i儀(r=0.908 0)，與文獻(xiàn)報道的結(jié)論相符[11]。也有報道認(rèn)為，當(dāng)PLT數(shù)在20×109～50×109L-1及10×109～20×109L-1時，PLT-I法的AUC為0.895和0.830[12]，表明PLT計數(shù)減少導(dǎo)致PLT-I檢測的準(zhǔn)確性下降，但是結(jié)果的可靠性依然較高。因此，在日常工作中對于低值PLT可使用PLT-I法檢測，必要時采用鏡檢法進(jìn)行確認(rèn)。當(dāng)懷疑低值結(jié)果是由標(biāo)本質(zhì)量問題或存在特殊情況干擾所導(dǎo)致時，更應(yīng)該采用鏡檢法以便直觀、真實地反映 PLT狀況[13]。本研究中選取的標(biāo)本例數(shù)尤其是極低值(<20×109L-1)的標(biāo)本較少，后續(xù)研究中，還需增加標(biāo)本數(shù)，以便對極低值標(biāo)本的檢測一致性進(jìn)行更客觀的評估。

[1] Briggs C，Harrison P，Machin S J．Continuing developments with the automated platelet count[J]．IntJLabHematlo，2007，29(2)：77-91．

[2] 凌 勵，周道銀，惠小陽，等．激光染色法與電阻抗法檢測PLT方法的比較[J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2004，27(10)：717-718.

[3] 中國合格評定國家認(rèn)可委員會．CNAS-CL02(ISO15189:2012)醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則[S]．北京：中國計量出版社，2013．

[4] 尚 紅，王毓三，申子瑜．全國臨床檢驗操作規(guī)程[M]．4版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2014．

[5] 中華人民共和國衛(wèi)生部.WS/T 347-2011 血細(xì)胞分析校準(zhǔn)指南[S]． 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011．

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.WS/T 406-2012臨床血液學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求[S]． 北京：人民衛(wèi)生出版社，2012．

[7] Rooh S． Implementation of international slide review criteria for improving the efficiency of the haematology laboratory[J]．ApolloMedicine，2010，7(11)：286-288．

[8] 王 悅，劉汝鋒，任穎佳，等．腫瘤?？蒲簭?fù)檢規(guī)則的初步建立和評價[J]．臨床檢驗雜志，2013，31(1)：1-3．

[9] 王月芳， 江詠梅， 張 鴿，等．婦兒?？漆t(yī)院血液分析復(fù)檢規(guī)則的建立及驗證[J]．檢驗醫(yī)學(xué)，2013，28(4)：296-300．

[10] 黃 媛，黃春梅，李建英，等．XN-2000血液分析儀低值PLT計數(shù)復(fù)檢規(guī)則的制定[J]．臨床檢驗雜志，2014，32(1)：48-51．

[11] 胡梅霞，李學(xué)梅．4種檢測方法在低值血小板計數(shù)中的應(yīng)用比較[J]．檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14(12)：1828-1830．

[12] 張 蕾，李晶華，李 智，等．Sysmex XE-2100全自動血液分析儀對低值血小板檢測應(yīng)用探討[J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，33(5)：457-459．

[13] 華 江，潘 揚．不同檢測方法計數(shù)血小板的準(zhǔn)確性評價[J]．臨床檢驗雜志，2015，33(1)：12-13．