許珊珊， 李奇淵,2， 吳謹(jǐn)準(zhǔn)， 陳國兵， 朱碧溱， 谷為岳

慢性肉芽腫病(chronic granulomatous disease，CGD)是一種罕見的原發(fā)性免疫缺陷病，是因編碼NADPH氧化酶的基因缺陷引起。CGD的遺傳方式有X連鎖隱性遺傳(XR-CGD)及常染色體隱性遺傳(AR-CGD)等，其中X連鎖隱性遺傳更為常見[1]。XR-CGD是由編碼NADPH氧化酶的蛋白亞基gp91phox的CYBB基因突變引起[2-4]。2015年7月15日，筆者醫(yī)院收治1例臨床表現(xiàn)為反復(fù)感染，入院24 h內(nèi)迅速死亡的患者，采用二代測(cè)序方法進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析，對(duì)患者及家屬進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該患者攜帶CYBB基因上一個(gè)錯(cuò)義突變(c.949T>A, p.M312K)，為半合子突變，確診為XR-CGD，報(bào)道如下。

1 病例介紹

1.1臨床資料 患者，男性，1歲3月，以“發(fā)熱10余天”為主訴入院?；颊呷朐呵?0余天無明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，經(jīng)退熱抗感染治療無效，伴精神差、納差。出生后正常接種卡介苗?；純?月大時(shí)出現(xiàn)左腋下淋巴結(jié)腫大，生后多次反復(fù)發(fā)熱，反復(fù)發(fā)生肛周膿腫及頭皮癤腫。入院查體：體溫36.0 ℃，脈搏116 min-1，呼吸32 min-1，血壓120/68 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)，動(dòng)脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)96%。面色蒼白，精神差，全身皮膚散在陳舊性皮疹，部分有結(jié)痂，左腋下可及一腫大淋巴結(jié)，大小約4 cm×5 cm，邊界清楚，無觸痛，余淺表淋巴結(jié)未觸及腫大。咽充血，咽后壁可見一潰瘍，未見分泌物。頸軟。雙肺呼吸音粗，未聞及干、濕啰音。心音有力，律齊，心前區(qū)聞及Ⅱ/Ⅵ收縮期雜音。腹稍脹，肝肋下4～5 cm可及腫大，脾肋下未觸及腫大，腸鳴音4 min-1，肛周及外陰皮膚潮紅，未見破損。病理征陰性，CRT 1 s。入院后患兒生命征不穩(wěn)定，出現(xiàn)休克癥狀，予擴(kuò)容補(bǔ)液、抗感染、呼吸機(jī)輔助通氣，予血管活性藥物、輸注血液制品、鎮(zhèn)靜等對(duì)癥處理。后患兒出現(xiàn)心跳驟停，經(jīng)搶救無效于2015-07-16死亡。

1.2二代測(cè)序 在知情同意的前提下，采集患者及其家屬全血各2 mL(EDTA抗凝血)，使用血液基因組中量提取試劑盒(Blood Gen Midi Kit，中國CWBIO公司)提取全基因組DNA。參考文獻(xiàn)及OMIM數(shù)據(jù)庫、NCBI數(shù)據(jù)庫的信息，將人類已知的全部(約2萬個(gè))基因的基因組外顯子區(qū)域定制羅氏Nimble Gen捕獲探針，進(jìn)行全外顯子捕獲。合格的基因組DNA被Cavoris儀隨機(jī)打斷至200 bp左右，片段化DNA在Klenow Fragment、T4 DNA polymerase和T4PNK的作用下進(jìn)行末端補(bǔ)平修復(fù)。在聚合酶體系下，使上一步得到的修復(fù)產(chǎn)物在3′末端加上A堿基，最后在兩端加上接頭。加上接頭后的連接產(chǎn)物經(jīng)4～6輪LM-PCR擴(kuò)增，將文庫與探針雜交60～68 h，使用鏈霉素磁珠進(jìn)行洗脫，洗脫產(chǎn)物經(jīng)10輪LM-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在Illumina hiseq2500平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)利用Illumina的軟件進(jìn)行分析處理。參考序列為hg19基因組。根據(jù)測(cè)序深度及突變質(zhì)量，對(duì)檢測(cè)到的變異進(jìn)行過濾篩選，依據(jù)1000Genomes Project，Exome Variant Server (EVS)及Exome Aggregation Consortium (ExAC)數(shù)據(jù)庫，濾除人群中突變頻率>1%的變異，去除內(nèi)含子變異、同義變異(除外位于剪切位點(diǎn)的變異)等，篩選出可能致病的變異，同時(shí)使用SIFT等軟件對(duì)篩選出的突變對(duì)蛋白功能的影響進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)合患兒的臨床表現(xiàn)及遺傳方式，得到可能致病的突變。

1.3一代測(cè)序(Sanger法)驗(yàn)證 根據(jù)CYBB基因所驗(yàn)證位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI 3730XL測(cè)序儀測(cè)序，基因序列分析采用DNASTAR軟件進(jìn)行序列分析和比對(duì)。

1.4結(jié)果

1.4.1實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 該患兒血液免疫功能相關(guān)檢查基本正常(表1)。

表1 患兒血液實(shí)驗(yàn)室檢查相關(guān)結(jié)果

1.4.2測(cè)序結(jié)果 目標(biāo)區(qū)域平均測(cè)序深度為66.08，目標(biāo)區(qū)域覆蓋度99.7%，89.76%目標(biāo)區(qū)域>10×覆蓋度，78.11%目標(biāo)區(qū)域>20×覆蓋度。

二代測(cè)序方法進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)患者的CYBB基因第9外顯子存在半合子突變，進(jìn)一步對(duì)患者及其家屬用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證該位點(diǎn)的突變情況，證明患者CYBB基因攜帶一個(gè)已知錯(cuò)義突變(c.949T>A, p.M312K)，來源于母親及外婆(圖1)，而其小姨并未攜帶該突變(參考序列NM-000397.3)。全外顯子測(cè)序結(jié)果還顯示，與免疫缺陷性疾病有關(guān)的3個(gè)基因存在堿基變異(表2)，但后續(xù)通過遺傳方式及與臨床表型的關(guān)聯(lián)程度排除了該3個(gè)變異的致病性。

2 討 論

A：患者家系圖，其母親、外祖母均為該突變的攜帶者；B：患者及其父母、外婆、小姨Sanger測(cè)序驗(yàn)證CYBB基因c.949堿基改變. 參考序列NM-000397.3.圖1 患者家系圖及測(cè)序圖譜Fig 1 Pedigree and Sanger sequencing resultsof the family

Tab2Summary of variations in other genes related with immunodeficiency disease revealed by whole exome sequencing in this patient

基因染色體位置核酸改變氨基酸改變Rs編號(hào)突變類型SELPChr1c．1334G>C(E9)p．445，A>Grs116959152雜合NCF2Chr1c．836G>A(E8)p．279，T>Mrs13306581雜合ZAP70Chr2c．66G>T(E3)p．22，E>D-雜合

CGD是一種罕見的原發(fā)性免疫缺陷病，是由吞噬細(xì)胞功能缺陷引起的，發(fā)病率大約為1/250 000～1/200 000。其主要臨床表現(xiàn)是嚴(yán)重的反復(fù)的細(xì)菌及真菌感染，以及因反復(fù)炎癥造成的胃腸道、泌尿生殖道等器官的肉芽腫增生。臨床診斷主要依靠典型的臨床癥狀、硝基四唑氮藍(lán)(NBT)試驗(yàn)及中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)等[5-6]，確診仍需依靠基因檢測(cè)。本研究中，患者入院時(shí)已處于感染導(dǎo)致膿毒血癥的狀態(tài)，后迅速出現(xiàn)休克，于入院第2天搶救無效死亡。結(jié)合患者既往多次感染病史，考慮其患有某種免疫缺陷病，患者死亡時(shí)免疫功能相關(guān)檢查(體液免疫及細(xì)胞免疫功能)尚未回報(bào)，因此在征得患者家屬同意的情況下，及時(shí)外送基因檢測(cè)公司進(jìn)行全外顯子測(cè)序，最終證實(shí)了XR-CGD的診斷?；仡櫺苑治鲈摶颊叩呐R床表現(xiàn)，與CGD相符。其主要表現(xiàn)為反復(fù)感染，感染部位累及皮膚(頭皮、肛周)及肺，同時(shí)還有卡介苗接種同側(cè)腋窩淋巴結(jié)腫大。實(shí)驗(yàn)室檢查提示，細(xì)胞及體液免疫功能正常。因此，對(duì)于臨床上有患者出現(xiàn)反復(fù)感染，懷疑免疫缺陷，但常規(guī)細(xì)胞免疫及體液免疫功能卻正常的患者，應(yīng)考慮CGD可能。

CGD是因編碼NADPH氧化酶的基因缺陷引起。NADPH氧化酶由5個(gè)蛋白亞單位組成：gp91phox，p22phox，p47phox，p67phox，p40phox。其中XR-CGD是最常見的類型，約占CGD病例的60%，是由編碼gp91phox蛋白的CYBB基因突變引起[3-4]。CYBB基因位于Xp21.1，該基因長30 kb，包含13個(gè)外顯子。據(jù)HGMD網(wǎng)站報(bào)道，截止至2015年12月已發(fā)現(xiàn)CYBB基因突變700余種，最常見的突變類型是錯(cuò)義突變。不同的突變引起吞噬細(xì)胞gp91phox蛋白功能表達(dá)的不同，從而引起氧化酶功能障礙[2]。

本例患者攜帶的突變?yōu)閏.949T>A，引起第312位蛋白質(zhì)由蛋氨酸變?yōu)橘嚢彼帷Ｔ撏蛔冇蒐ee于2008年報(bào)道[7]，Lee的研究中攜帶該突變的患者的臨床表現(xiàn)為肺膿腫、肛周膿腫及淋巴結(jié)炎，無結(jié)核及卡介苗接種并發(fā)癥。本研究中，患者接種卡介苗的同側(cè)腋窩淋巴結(jié)出現(xiàn)明顯腫大，余淋巴結(jié)未見腫大，但因未行淋巴結(jié)活檢，未能推測(cè)其是否有淋巴結(jié)結(jié)核或卡介苗感染。Lee等報(bào)道，17例患者中有14例患有結(jié)核或卡介苗相關(guān)并發(fā)癥，患病率較高[7]。在我國，卡介苗屬于計(jì)劃免疫的部分，一般在生后3 d內(nèi)接種，所以對(duì)于有免疫缺陷病家族史的患兒，避免接種卡介苗可減少結(jié)核或卡介苗感染的發(fā)病率。目前美國已采用TREC試驗(yàn)對(duì)重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immunodeficiency, SCID)進(jìn)行篩查[8]，期待未來能針對(duì)CGD、SCID等免疫缺陷病開展新生兒篩查。

Roos等還報(bào)道過1例CYBB基因第312位蛋白質(zhì)改變的病例[2]。該患者的947位堿基T被替換為G，從而導(dǎo)致蛋氨酸變?yōu)榫彼幔M(jìn)行蛋白表達(dá)及酶學(xué)測(cè)定后，判定其為x91+型，即gp91phox蛋白表達(dá)正常，NADPH氧化酶活性缺失[4]。本病例與該病例相比，同為第949位堿基發(fā)生改變，導(dǎo)致312位蛋白質(zhì)變?yōu)榫彼峄蛸嚢彼幔呔袔д姾傻膫?cè)鏈，同為堿性氨基酸。所以推測(cè)c.949T>A(p.M312K)可能也為x91+型，可引起酶活性基本缺失。

近幾年，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，費(fèi)用降低，測(cè)序速度加快，已成為罕見單基因遺傳病診斷的重要方法之一。通過二代測(cè)序技術(shù)，可以快速地對(duì)目的基因組合或全外顯子進(jìn)行測(cè)序，使得對(duì)罕見病、疑難病的診斷變得更加容易[9]。如本例患者，病情進(jìn)展迅速，入院1 d內(nèi)即死亡，臨床實(shí)驗(yàn)室檢查尚來不及完善，而通過二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析，明確診斷，并可對(duì)家屬提供遺傳咨詢。由于同時(shí)對(duì)全外顯子進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果可能會(huì)提示多個(gè)基因攜帶變異。如本研究全外顯子測(cè)序結(jié)果顯示了另外3個(gè)與免疫缺陷性疾病有關(guān)的基因上存在堿基變異。與SELP基因及NCF2基因相關(guān)的疾病為遺傳性IgE反應(yīng)過敏癥及遺傳CGD細(xì)胞色素B陽性2型，均為常染色體顯性遺傳，但在此2個(gè)基因上發(fā)現(xiàn)的變異均為NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫中記載的已知SNP位點(diǎn)，其臨床意義為良性。因ZAP70突變引起的選擇性T細(xì)胞缺陷病為常染色體隱性遺傳病，該患者攜帶ZAP70雜合突變，故不會(huì)致病。所以全外顯子測(cè)序檢測(cè)出的這3個(gè)基因變異均無臨床意義。這就需要臨床醫(yī)師進(jìn)行鑒別分析，過濾或剔除無用信息，找到真正的致病突變。

綜上所述，對(duì)于臨床癥狀不典型，或因不可抗拒原因(如患者死亡)而造成臨床資料不完善，無法進(jìn)行臨床診斷時(shí)，采用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行目的基因組合或全外顯子測(cè)序，可以幫助醫(yī)師明確診斷，并對(duì)患者家庭提供可靠的遺傳咨詢。

[1] Segal B M, Leto T L, Gallin J I,etal. Genetic, biochemical and clinical features of chronic granulomatous disease[J].Medicine(Baltimore), 2000,79:170-200.

[2] Roos D, De Boer M, Kuribayashi F,etal. Mutations in the X-linked autosomal recessive forms of chronic granulomatous disease[J].Blood, 1996,87:1663-1681.

[3] Rae J, Newburger P E, Dinauer M C,etal. X-linked chronicgranulomatous disease: Mutations in the CYBB gene encoding the gp91-phox-component of therespiratory burst oxidase[J].AmJHumGenet, 1998,62:1320-1331.

[4] Roos D, Kuhns D B, Maddalena A,etal. Hematologically important mutations: X-linked chronic granulomatous disease (third update)[J].BloodCellsMolDis, 2010,45(3):246-265.

[5] Ochs H D, Igo R P. The NBT slide test: a simple screening method for detecting chronic granulomatous disease and femalecarriers[J].JPediatr, 1973,83(1):77-82.

[6] Alvarez-Larran A, Toll T, Rives S,etal. Assessment ofneutrophil activation in whole blood by flow cytometry [J].ClinLabHaematol, 2005,27(1):41-46.

[7] Lee P P, Chan K W, Jiang L,etal. Susceptibility to mycobacterial infections in children with X-linked chronic granulomatous disease[J].PediatrInfectDisJ, 2008,27(3):224-230.

[8] Chinn I K, Shearer W T. Severe combined immunodeficiency disorders[J].ImmunolAllergyClinNorthAm, 2015,35(4):671-694.

[9] Yu Y, Wu B L, Wu J,etal. Exome and whole-genome sequencing as clinical tests: a transformative practice in molecular diagnostics[J].ClinChem, 2012,58(11):1507-1509.