羅洞波， 趙書(shū)源， 何 丹

含鉑類(lèi)的兩藥聯(lián)合化療是目前非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer, NSCLC)的一線(xiàn)化療方案[1]。鉑類(lèi)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)水解成雙氯雙氨鉑，然后形成DNA-鉑類(lèi)復(fù)合物，阻止腫瘤細(xì)胞DNA的復(fù)制，發(fā)揮其細(xì)胞毒性作用。腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥，將嚴(yán)重影響NSCLC的治療效果。目前，已知核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)是順鉑耐藥的重要機(jī)制之一，而切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementation group 1, ERCC1)是NER途徑的重要因素，在順鉑耐藥中起重要作用。

ERCC1位于人類(lèi)染色體19q13.2，是一種單鏈DNA核酸內(nèi)切酶，是NER途徑的限速酶，而NER途徑在機(jī)體DNA損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ERCC1的表達(dá)在一定水平上反映DNA的修復(fù)能力(DNA repair capability, DRC)。機(jī)體DRC降低，使得細(xì)胞DNA損傷不能及時(shí)得到修復(fù)，從而增強(qiáng)肺癌易感性。相反，ERCC1過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致DNA-鉑類(lèi)復(fù)合物的修復(fù)，產(chǎn)生鉑類(lèi)耐藥。目前，關(guān)于ERCC1的臨床研究多為回顧性研究，主要針對(duì)晚期的NSCLC患者，研究結(jié)果表明，ERCC1的表達(dá)可以作為順鉑敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)[2-4]。一項(xiàng)關(guān)于ERCC1 mRNA的NSCLC的臨床試驗(yàn)表明，腫瘤組織中ERCC1 mRNA水平與順鉑的兩藥聯(lián)合方案反應(yīng)率密切相關(guān)[5]。Meta分析表明，ERCC1是晚期NSCLC患者對(duì)鉑類(lèi)的反應(yīng)率和總生存期的重要指標(biāo)[6]。因此,有必要在NSCLC術(shù)后人群中對(duì)這一指標(biāo)進(jìn)行預(yù)后驗(yàn)證性分析。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2010年1月1日-2014年12月31日接受標(biāo)準(zhǔn)肺癌根治術(shù)(肺葉切除+系統(tǒng)性縱膈淋巴結(jié)清掃)的NSCLC患者137例，男性86例，女性51例；年齡(64±18)歲。Ⅰ期49例，Ⅱ期34例，Ⅲ期54例(UICC2007版)；鱗癌57例，腺癌80例?；颊叩囊话闱闆r見(jiàn)表1。

入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后進(jìn)行規(guī)律隨訪(fǎng)；(2)未接受過(guò)術(shù)前放化療；(3)Ⅰ期患者術(shù)后未行術(shù)后輔助化療，Ⅱ及Ⅲ期患者術(shù)后接受過(guò)系統(tǒng)性含鉑方案兩藥聯(lián)合化療4周期；(4)有癌組織和癌旁組織病理標(biāo)本。

1.2隨訪(fǎng)情況 采取電話(huà)隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)時(shí)間自手術(shù)之日起，截止至2016年1月1日，隨訪(fǎng)率95%。終點(diǎn)事件為腫瘤復(fù)發(fā)或患者死亡。評(píng)價(jià)指標(biāo)為患者1，2及3年的無(wú)病生存(disease-free survival，DFS)率和總生存(overall survival，OS)率。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料和ERCC1的表達(dá)情況

☆：每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù). ERCC1:切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1.

1.3免疫組織化學(xué)方法 參照文獻(xiàn)[6]，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ERCC1。取NSCLC組織與肺組織蠟塊，切片厚5 μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，以3%的H2O2溫育20 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗3次，每次5 min；高溫抗原修復(fù)10 min，0.1 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；滴加正常血清封閉液，室溫溫育30 min，除去多余液體；滴加1∶80鼠抗人ERCC1單抗(1∶100倍稀釋)，37 ℃ 1 h，4 ℃冰箱放置過(guò)夜；0.1 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃ 60 min。0.1 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；滴加試劑SABC，37 ℃ 60 min，0.1 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；DAB顯色5 min；蘇木精復(fù)染，脫水。二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。由2位病理科高級(jí)職稱(chēng)醫(yī)師隨機(jī)獨(dú)立閱片后，取平均分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]介紹的方法，即每張切片隨機(jī)觀(guān)察5個(gè)高倍(×400)視野，并計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。采用細(xì)胞顯色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比的乘積求得半定量H-score評(píng)分，作為蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。具體評(píng)分方法為：(1)按顯色程度分4級(jí)：陰性(不著色)、弱陽(yáng)性(淡黃色)、陽(yáng)性(棕黃色)、強(qiáng)陽(yáng)性(棕褐色)，分別計(jì)0，1，2，3分；(2)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比：無(wú)(0)、1%～9%(0.1)、10%～50%(0.5)、>50%(1.0)。ERCC1在鱗癌和腺癌組織強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果(即H-score=3)，染色定位于細(xì)胞核內(nèi)(圖1A，1B);ERCC1在鱗癌和腺癌陰性染色結(jié)果(即H-score=0)(圖1C，1D)。癌組織中位評(píng)分為2，癌旁組織中位評(píng)分為0.5。因此將癌組織中H-score評(píng)分≥2認(rèn)定為陽(yáng)性(即腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度>2，且染色百分比>50%)；反之為陰性。

ERCC1在細(xì)胞中定位于細(xì)胞核內(nèi)，A和B即鱗癌和腺癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果(H-score=3)，C和D為鱗癌和腺癌中陰性結(jié)果(H-score=0).圖1 ERCC1在癌組織和癌旁組織的表達(dá)Fig 1 ERCC1 expression in the NSCLC tumor and adjacent tissues

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，一般臨床資料比較采用χ2檢驗(yàn)和非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法中Breslow檢驗(yàn)。多因素分析采用Cox回歸模型。P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ERCC1在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 137例NSCLC患者ERCC1癌旁組織或癌組織的H-score評(píng)分如下：0～0.5分為120和26例；1～1.5分為16和34例，2～3分為1和77例(圖2A)。癌組織的中位評(píng)分為2分，高于癌旁組織的中位評(píng)分0.5分，非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖2B)。依照判定標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤組織中ERCC1陽(yáng)性65例(47.4%)，陰性72例(52.6%)。

2.2癌組織中的ERCC1的表達(dá)與病理類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)及吸煙的關(guān)系 鱗癌組織中ERCC1的表達(dá)率(61.4%，35/57)高于其在腺癌組織的表達(dá)率(37%，30/80)(P=0.006，表1)，在組織學(xué)分級(jí)方面，ERCC1的表達(dá)率也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.022)，隨著分化程度的降低，ERCC1的表達(dá)呈增高趨勢(shì)。另外，吸煙患者癌組織中ERCC1的表達(dá)率(62.1%，41/66)高于非吸煙患者(33.8%，24/71)(P=0.001)。腫瘤組織中ERCC1的表達(dá)率與年齡、性別、病理分期、T分期、N分期及放化療史等無(wú)關(guān)。

A：柱狀圖；B：箱式圖. ☆：P<0.001.圖2 ERCC1在癌組織和癌旁組織的H-score評(píng)分Fig 2 ERCC1 H-score in the NSCLC tumor and adjacent tissues

2.3ERCC1對(duì)NSCLC術(shù)后患者預(yù)后的影響 在DFS方面，ERCC1表達(dá)陽(yáng)性的患者1，2，3年的DFS率分別為79.5%，70.1%和52.4%，中位DFS時(shí)間為22.17月(9.85～34.49月)；ERCC1表達(dá)陰性的患者1，2，3年DFS率為85.4%，76.8%和66.8%，中位DFS時(shí)間為28.4月(19.34～37.46月)(表2)。Kaplan-Meier生存分析顯示，ERCC1陰性患者的DFS優(yōu)于ERCC1陽(yáng)性患者(P=0.031，圖3A)。在OS方面，ERCC1表達(dá)陽(yáng)性的患者1，2，3年的OS率分別為87.4%，67.5%和64.7%，中位OS時(shí)間為51.33月(42.186～61.574月)；ERCC1表達(dá)陰性的患者1，2，3年OS率分別為94.2%，87.3%和84.6%。生存分析顯示，ERCC1陰性患者的OS優(yōu)于ERCC1陽(yáng)性患者(P=0.012，圖3B)。

因輔助放化療的混雜因素的影響，本研究將Ⅱ及Ⅲ期患者數(shù)據(jù)合并進(jìn)行亞組分析。ERCC1的表達(dá)對(duì)于Ⅰ期患者的DFS和OS差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)；在Ⅱ及Ⅲ期患者中，ERCC1的表達(dá)在DFS差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C)，但ERCC1陰性患者的3年OS(73.5%)高于ERCC1陽(yáng)性的患者(56.4%)(P=0.026，圖3D)。

對(duì)組織學(xué)類(lèi)型進(jìn)行亞組分析，結(jié)果如表4所示，鱗癌中ERCC1陰性的患者3年的DFS率和OS率分別為40.5%和69.0%，中位DFS時(shí)間為33.59月(13.658～53.512月)。鱗癌ERCC1陽(yáng)性患者3年的DFS率和OS率分別為14.6%和57.1%，中位DFS時(shí)間為13.78月(2.631～24.565月)。Kaplan-Meier生存分析顯示，鱗癌組織中ERCC1表達(dá)陰性的患者DFS和OS均優(yōu)于ERCC1陽(yáng)性患者(P=0.041，0.045；圖3E，3F)。腺癌中ERCC1陰性的患者3年DFS率和OS率分別為27.1%和82.4%，中位DFS時(shí)間為27.97月(17.585～38.351月)；腺癌ERCC1陽(yáng)性患者3年DFS率和OS率分別為31.9%和73.5%，中位DFS時(shí)間為26.27月(13.848～53.302月)。在腺癌組織中，ERCC1的表達(dá)與患者的DFS及OS差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 ERCC1的表達(dá)對(duì)NSCLC術(shù)后患者預(yù)后的影響

NSCLC:非小細(xì)胞肺癌； DFS：無(wú)病生存； OS：總生存.

DFS：無(wú)病生存； OS：總生存. ERCC1對(duì)患者DFS(A)和OS(B)的影響；ERCC1對(duì)Ⅱ及Ⅲ期患者DFS(C)和OS(D)的影響；ERCC1對(duì)鱗癌患者DFS(E)和OS(F)的影響.圖3 ERCC1的表達(dá)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的影響Fig 3 Effects of ERCC1 expression on the DFS and OS in NSCLC patients

此外，COX回歸多因素生存分析結(jié)果顯示，病理分期是影響患者DFS的唯一獨(dú)立因素，而病理分期、T分期及ERCC1的表達(dá)是影響NSCLC患者OS的獨(dú)立因素(表5)。

表3 ERCC1對(duì)Ⅰ期和Ⅱ+Ⅲ期NSCLC患者預(yù)后的影響

NSCLC:非小細(xì)胞肺癌； DFS：無(wú)病生存； OS：總生存.

表4 ERCC1對(duì)NSCLC術(shù)后患者鱗癌和腺癌預(yù)后的影響

NSCLC:非小細(xì)胞肺癌； DFS：無(wú)病生存； OS：總生存.

表5 COX回歸多因素分析NSCLC術(shù)后患者的預(yù)后

NSCLC:非小細(xì)胞肺癌； DFS：無(wú)病生存； OS：總生存.

3 討 論

含鉑方案的兩藥聯(lián)合化療是治療NSCLC的重要手段之一，但總有效率僅為20%～40%。近年來(lái)隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，在肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌的基礎(chǔ)研究方面，通過(guò)干擾ERCC1的表達(dá)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類(lèi)藥物的敏感性[8-11]。臨床方面Olaussen等通過(guò)對(duì)Ⅰ～Ⅲ期NSCLC根治術(shù)后患者大體標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，含鉑類(lèi)的化療能使ERCC1陰性的患者生存獲益，而ERCC1高表達(dá)者則不能。提示ERCC1高表達(dá)意味著對(duì)鉑類(lèi)耐藥[12]。Sad等對(duì)局部進(jìn)展期NSCLC化療研究結(jié)果顯示，ERCC1陰性的患者總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均優(yōu)于ERCC1陽(yáng)性的患者[7]。Hubner等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鉑類(lèi)治療的NSCLC患者ERCC1高表達(dá)強(qiáng)烈提示預(yù)后差；在未治患者中卻不然；而且ERCC1高表達(dá)患者對(duì)鉑類(lèi)治療耐藥[13]。因此目前觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，ERCC1在局部進(jìn)展期肺癌患者的含鉑類(lèi)化療中起著重要的預(yù)測(cè)作用。本研究結(jié)果顯示，雖然ERCC1的表達(dá)對(duì)于NSCLC患者總的3年DFS和OS均有影響(P<0.05)；但對(duì)于Ⅰ期患者3年DFS和OS均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。究其原因可能有兩點(diǎn)：(1)Ⅰ期患者預(yù)后較好，3年隨訪(fǎng)時(shí)間過(guò)短；(2)Ⅰ期患者未常規(guī)接受術(shù)后輔助化療，故無(wú)法反應(yīng)出ERCC1對(duì)化療的預(yù)測(cè)作用。對(duì)于Ⅱ及Ⅲ期患者，ERCC1只對(duì)OS有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而對(duì)DFS卻無(wú)影響。由于Ⅱ及Ⅲ期患者術(shù)后常規(guī)接受全身化療，提示術(shù)后化療對(duì)于ERCC1陰性的患者可能并不能延緩腫瘤的復(fù)發(fā)，但可延長(zhǎng)患者的帶瘤生存時(shí)間；反之，ERCC1陽(yáng)性的患者可能意味著腫瘤耐藥和化療失敗。

本研究數(shù)據(jù)還顯示，長(zhǎng)期吸煙患者中ERCC1的表達(dá)率(62.1%)遠(yuǎn)高于非吸煙患者(37.9%)；肺鱗癌組織中ERCC1的表達(dá)率(61.4%)要明顯高于肺腺癌組織(37.5%)(P<0.05)，這與Olaussen等報(bào)道的ERCC1在鱗癌(55.4%)、腺癌(29.3%)中的表達(dá)率相似[12]。預(yù)后結(jié)果分析也顯示，在鱗癌患者中，ERCC1表達(dá)陰性的3年DFS率(40.7%)和OS率(68.4%)優(yōu)于ERCC1表達(dá)陽(yáng)性的患者3年DFS率(14.8%)和OS率(57.7%)，提示ERCC1、吸煙、鱗癌三者之間可能存在某種聯(lián)系?；A(chǔ)研究已證實(shí)，吸煙不僅能誘導(dǎo)DNA損傷從而刺激DNA修復(fù)，而且可以誘導(dǎo)小鼠的肺組織內(nèi)支氣管鱗狀上皮化生和p-p38的激活[14]，而ERCC1的表達(dá)調(diào)控與p38信號(hào)通路密切相關(guān)。研究證實(shí)，利用干擾技術(shù)或抑制劑阻斷p38信號(hào)通路能夠降低ERCC1的表達(dá)，從而增強(qiáng)多種化療藥物的敏感性[15]。目前已有部分p38抑制劑進(jìn)入Ⅰ～Ⅱ期臨床試驗(yàn)，用于治療自身免疫系統(tǒng)疾病[16-17]。因此p38信號(hào)通路或許能夠?yàn)閷?lái)以ERCC1為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療帶來(lái)新的研究方向。

綜上所述，NSCLC腫瘤組織中ERCC1的表達(dá)是影響患者預(yù)后的重要指標(biāo)，特別對(duì)于Ⅱ及Ⅲ期接受術(shù)后輔助化療的患者，此外ERCC1在鱗癌和吸煙患者腫瘤組織中表達(dá)率較高，ERCC1陰性的鱗癌患者預(yù)后優(yōu)于ERCC1陽(yáng)性的鱗癌患者。

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