孫士鵬 安成 劉貴建 吳志奎

細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）包括外泌體（exosomes）、外體（ectosomes）、微泡（microvesicles）、微粒（microparticles）、凋亡小體（apoptotic bodies）等成分［1］。這些細(xì)胞分泌的EVs存在很大的異質(zhì)性，目前依據(jù)透射電鏡、免疫電鏡和其他生物化學(xué)的方法，可把EVs主要分為外泌體和微泡2大類［2］。外泌體是多種活細(xì)胞晚期內(nèi)體分泌的30～100 nm的小囊泡體，在蔗糖密度梯度溶液中密度范圍為1.13～1.19 g/mL［3］。EVs的主要功能是作為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNAs的遞送載體，介導(dǎo)體內(nèi)不同細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通訊，從而影響正常和病理狀態(tài)。最初外泌體的發(fā)現(xiàn)源于紅細(xì)胞成熟，外泌體與紅系分化關(guān)系極為密切。EVs及其攜帶的miRNA等分子的功能研究主要集中在紅細(xì)胞發(fā)育分化成熟的調(diào)控以及臨床用紅細(xì)胞制品領(lǐng)域，本文就紅細(xì)胞生成和紅細(xì)胞制品的相關(guān)EVs研究進(jìn)展進(jìn)行論述，以期為紅細(xì)胞疾病的相關(guān)機(jī)制研究以及疾病治療提供新的思路。

1 細(xì)胞外囊泡的定義及其發(fā)現(xiàn)

1.1 細(xì)胞外囊泡的定義及生成

EVs是在多囊泡胞內(nèi)體（multivesicular endosome，MVE）成熟過程中，由內(nèi)體膜通過內(nèi)出芽形成的管腔內(nèi)囊泡，隨后通過MVE與細(xì)胞膜融合的方式釋放到細(xì)胞外［4］。EVs廣泛存在于精液、血液、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水液和腦脊液等體液中［5］。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道包括樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、表皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和許多腫瘤細(xì)胞等在內(nèi)的幾乎所有的細(xì)胞都能分泌外泌體［1］。EVs形成和排出細(xì)胞的過程中主要依靠4種內(nèi)體分選復(fù)合物（ESCRT0，I，II，III）把細(xì)胞內(nèi)含物、跨膜蛋白以及膜周邊蛋白質(zhì)摻入到外泌體中［6］。作為EVs的主要存在形式，外泌體也可以以ESCRT非依賴的方式形成，四跨膜蛋白CD63、CD81、CD9也直接參與各種“貨物”向外泌體的分選［7］。

1.2 細(xì)胞外囊泡的發(fā)現(xiàn)源于紅細(xì)胞成熟

紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，主要功能是在脊椎動(dòng)物體內(nèi)運(yùn)送氧氣的最主要的媒介，同時(shí)還具有免疫功能。EVs發(fā)現(xiàn)源于紅細(xì)胞成熟，隨著EVs研究的火熱化，其在紅系分化中的作用也被逐步揭示出來。20世紀(jì)80年代研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞等分泌小囊泡，并定義了外泌體，即起源于網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟時(shí)細(xì)胞外部膜囊泡。外泌體曾一度被視為是紅細(xì)胞成熟時(shí)去除的胞內(nèi)廢棄物。直到20世紀(jì)末才發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞分泌的外泌體能夠攜帶并運(yùn)輸功能性的抗原提呈復(fù)合物，提出外泌體可能是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞之間的通信運(yùn)載體［8-9］?？梢娡饷隗w與紅細(xì)胞的研究有很深的淵源，科學(xué)界對(duì)其功能認(rèn)知也經(jīng)歷了否定之否定的過程。

2 細(xì)胞外囊泡的功能研究進(jìn)展

幾乎所有細(xì)胞都能分泌EVs［1］，在多種體液中存在的EVs通過將核酸和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞和組織中，在細(xì)胞-細(xì)胞通訊中起關(guān)鍵作用。外泌體攜帶多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNAs，目前外泌體結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)庫ExoCarta（http：//exocarta.org/）數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)鑒定出外泌體含有9 769種蛋白、3 408種mRNA和2 838種miRNA。不同的細(xì)胞來源EVs，通常攜帶有獨(dú)特的貨物如miRNA或整合素，因而可作為相關(guān)疾病的分子標(biāo)記物。多用于腫瘤診斷以確定特異性癌癥亞型，例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者血清外泌體包含特征性EGFRvⅢ突變體基因mRNA和miRNA可能作為疾病診斷的標(biāo)志物［10］。EVs尤其是外泌體介導(dǎo)體內(nèi)不同細(xì)胞類型如腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞等細(xì)胞之間的通訊，因而在炎癥反應(yīng)、腫瘤血管生成、組織炎癥、免疫重建、腫瘤免疫治療等方面發(fā)揮重要作用［11-12］。例如EVs能在未來轉(zhuǎn)移部位與腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞相互作用，以促進(jìn)擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，并增加腫瘤細(xì)胞侵襲性［10］。

3 紅細(xì)胞中的細(xì)胞外囊泡

3.1 紅細(xì)胞成熟過程中的細(xì)胞外囊泡研究

紅系分化從造血干細(xì)胞開始，逐漸失去分化潛能，經(jīng)歷早期紅系集落生成細(xì)胞（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）和紅細(xì)胞系集落形成單位（colony-forming unit-erythroid，CFU-E）最終脫核和變形成為有功能的成熟紅細(xì)胞。造血前體細(xì)胞主要存在于骨髓中，少量釋放到外周血中。成熟紅細(xì)胞中含有血紅蛋白但是沒有細(xì)胞核和線粒體，因而成熟紅細(xì)胞內(nèi)沒有DNA僅有少量殘存的RNA。HBB是血紅蛋白β亞基的編碼基因，HBBmRNA不會(huì)在成熟紅細(xì)胞內(nèi)大量存在。Jun等［13］在外周血外泌體中可以檢測(cè)大量HBBmRNA，此結(jié)果說明含有大量HBBmRNA的外泌體應(yīng)該是來自骨髓紅系前體細(xì)胞釋放到外周血中，而不可能來源于外周血成熟紅細(xì)胞。這些含有大量HBBmRNA的外泌體是骨髓前體紅細(xì)胞代謝的廢物，還是主動(dòng)釋放到外周血中由紅細(xì)胞等攝取而發(fā)揮特定的功能尚未被揭示。

成熟紅細(xì)胞和紅系前體細(xì)胞膜蛋白存在差異，這些差異蛋白的表達(dá)也與外泌體關(guān)系密切。紅細(xì)胞在成熟過程中有一些不再需要的膜蛋白質(zhì)可以通過外泌體排除途徑釋放出紅細(xì)胞，致使成熟紅細(xì)胞表面此蛋白減少或缺失。例如：大部分成熟紅細(xì)胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrinreceptor，TfR）作為管腔內(nèi)囊泡的貨物通過MVE和隨后的外泌體釋放出來，其機(jī)制是基于細(xì)胞膜脂處理系統(tǒng)來調(diào)控膜蛋白的分選［14］。此外乙酰膽堿酯酶和整合素α4β1也可以通過外泌體排除途徑釋放出紅細(xì)胞，從而使細(xì)胞表面這些蛋白質(zhì)減少或消失［15］。網(wǎng)織紅細(xì)胞上整合素α4β1的存在會(huì)導(dǎo)致某些疾病的血液循環(huán)并發(fā)癥，因而通過外泌體清除紅細(xì)胞上的整合素α4β1非常重要。整合素α 4β1在造血祖細(xì)胞上表達(dá)，隨著紅系分化成熟細(xì)胞含量逐漸下調(diào)。外泌體上整合素α4β1能夠與內(nèi)皮細(xì)胞上的血管細(xì)胞粘附分子1（VACM-1）結(jié)合，可能參與了其他重要的功能。相反，部分膜蛋白則只存在于成熟紅細(xì)胞膜而外泌體膜上沒有表達(dá)或含量很低。例如：B-spectrin蛋白在網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟時(shí)不會(huì)從細(xì)胞膜上丟失，在網(wǎng)織紅細(xì)胞外泌體上檢測(cè)不到B-spectrin蛋白［16］。血型糖蛋白A（GPA）在紅系來源的外泌體上的分布也遠(yuǎn)低于紅細(xì)胞。還有一些蛋白在成熟紅細(xì)胞和紅細(xì)胞來源的外泌體上均有表達(dá)。ABCB6是ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員之一，被認(rèn)為是負(fù)責(zé)線粒體攝取卟啉的蛋白。Katalin等人［17］發(fā)現(xiàn)ABCB6既存在于成熟紅細(xì)胞上，在紅細(xì)胞成熟的最后步驟從網(wǎng)織紅細(xì)胞釋放的外泌體上也有表達(dá)，但是其功能還有待揭示。相比紅細(xì)胞的質(zhì)膜來說，紅細(xì)胞來源的外泌體膜中二酰基甘油（DAG）、膽固醇、補(bǔ)體受體1（CR1，CD35）和GPI錨定蛋白如CD55、CD59以及乙酰膽堿酯酶相對(duì)含量較高［18］。這些紅細(xì)胞來源的外泌體是否還發(fā)揮著重要的生理功能？還是作為代謝廢物經(jīng)過腎臟通過尿液排出體外？近期的一項(xiàng)針對(duì)鐮形紅細(xì)胞貧血的研究提示這些外泌體可能仍是具有功能性作用的。研究發(fā)現(xiàn)鐮形紅細(xì)胞貧血患兒血漿外泌體主要來源于紅細(xì)胞，其含量遠(yuǎn)高于健康對(duì)照組［19］。鐮形紅細(xì)胞貧血患者的EVs能顯著增加單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附功能、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素高表達(dá)，而且病情嚴(yán)重的鐮形紅細(xì)胞貧血患兒的EVs增加單核細(xì)胞粘附功能最強(qiáng)。紅細(xì)胞來源外泌體的功能還需要進(jìn)一步的關(guān)注和研究。

當(dāng)前對(duì)EVs及其裝載物的功能研究主要集中在miRNA領(lǐng)域，紅細(xì)胞相關(guān)EVs的miRNA研究也取得了一定的進(jìn)展。雖然成熟紅細(xì)胞內(nèi)僅殘留部分RNA，但是這些RNA包含了多種miRNA。Simonas等［20］使用磁珠分選系統(tǒng)從人外周血分離獲得CD235a+的紅細(xì)胞，提取RNA經(jīng)過Illumina HiSeq 2500測(cè)序鑒定出271種已知miRNA，而且每個(gè)樣本大多數(shù)miRNA的平均reads讀數(shù)＞1 000 reads。這說明成熟紅細(xì)胞分泌的外泌體中應(yīng)該裝載有miRNA，但是當(dāng)前紅細(xì)胞相關(guān)外泌體內(nèi)非編碼RNA功能研究較少，功能還有待揭示。miR-486是氧化應(yīng)激的急相反應(yīng)miRNA，在紅系分化過程中發(fā)揮非常重要的作用［21］，研究發(fā)現(xiàn)外泌體來源的miR-486可以靶向人紅系白血病TF-1細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白促進(jìn)細(xì)胞向紅系分化、增殖［22］。外泌體來源的miR-486等理論上能夠直接參與紅系分化和氧化應(yīng)激反應(yīng)，在紅細(xì)胞生成障礙、貧血等生物學(xué)過程中發(fā)揮的作用還需要進(jìn)一步研究。

3.2 紅細(xì)胞儲(chǔ)存過程中細(xì)胞外囊泡的研究

當(dāng)前紅細(xì)胞相關(guān)EVs的研究較多的集中在紅細(xì)胞制品領(lǐng)域。在血液儲(chǔ)存過程中，紅細(xì)胞經(jīng)歷新陳代謝和生化反應(yīng)都會(huì)顯著影響紅細(xì)胞膜的完整性、變形性和攜氧能力。由于輸血成分的變化可能會(huì)導(dǎo)致組織缺氧或者炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低輸血后受者存活率。雖然為了確保血液制品的安全性，在濃縮紅細(xì)胞制品（red blood cell concentrate，RCC）的加工和儲(chǔ)存中應(yīng)用了監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，但許多產(chǎn)品質(zhì)量特性受到制造方法和低溫保存的影響。目前，存儲(chǔ)持續(xù)時(shí)間對(duì)血液制品質(zhì)量和輸血結(jié)果的作用一直是研究的焦點(diǎn)。血液中的EVs是輸血后炎癥和凝血的潛在影響因素，在RCC的存儲(chǔ)過程中EV的異質(zhì)性可以作為紅細(xì)胞損傷的指示器［23］。研究者們［23］通過使用流式細(xì)胞術(shù)分析和可調(diào)電阻脈沖傳感設(shè)備進(jìn)行定量研究，在RCC產(chǎn)品中觀察到EV亞群和濃度以及細(xì)胞質(zhì)量參數(shù)的差異顯著，隨著低溫貯存期延長(zhǎng)，RCC的EVs的數(shù)量增加。

研究發(fā)現(xiàn)隨著紅細(xì)胞EVs的釋放，造成存儲(chǔ)紅細(xì)胞膜漸進(jìn)性和顯著的補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子（如CR1、CD55和CD59）的顯著缺失，這些EVs具有潛在的輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié)作用［24］。除了逐漸失去補(bǔ)體調(diào)節(jié)作用，儲(chǔ)存的紅細(xì)胞CR1功能損失導(dǎo)致儲(chǔ)存的紅細(xì)胞結(jié)合和清除補(bǔ)體調(diào)理的能力穩(wěn)步下降。雖然靜息的中性粒細(xì)胞比紅細(xì)胞表面的CR1表達(dá)量高出200～300倍，但是紅細(xì)胞CR1免疫復(fù)合物的親和力較中性粒細(xì)胞（PMN）CR1強(qiáng)，所以調(diào)理顆粒優(yōu)先結(jié)合到紅細(xì)胞CR1上［25］。臨床上常用的紅細(xì)胞制品的儲(chǔ)存時(shí)間在很大程度上影響了其釋放的外泌體等胞外囊泡的大小和濃度［26］。因而紅細(xì)胞制品相關(guān)EVs的研究對(duì)輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié)作用極為重要。因而，輸血相關(guān)EVs的研究報(bào)道目前還很少。

4 小結(jié)及展望

健康個(gè)體持續(xù)每秒合成約200萬的紅細(xì)胞替代衰老的紅細(xì)胞。這個(gè)新舊更替過程必須被嚴(yán)格控制以保證紅細(xì)胞數(shù)量能夠維持在一個(gè)很小的生理范圍內(nèi)。EVs是多種活細(xì)胞晚期內(nèi)體分泌的小囊泡體，主要功能是作為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等分子的運(yùn)送載體。相對(duì)EVs在腫瘤和炎癥等領(lǐng)域取得的成果來說，紅系分化和紅細(xì)胞制品相關(guān)的外泌體研究雖然有所進(jìn)展，但是仍然進(jìn)展緩慢。當(dāng)前EVs的研究主要受到分離純度和費(fèi)用的限制，降低分離純度成本并提高純度是亟待解決的主要問題。在分離純度方面，差速離心法結(jié)合超高速離心法仍是金標(biāo)準(zhǔn)的方法，可以獲得人外周血EVs包括外泌體、外體、微泡、微粒、凋亡小體等成分，如何對(duì)這些異質(zhì)性的EVs進(jìn)行研究？是通過物理化學(xué)的方法對(duì)不同大小的EVs進(jìn)行分門別類的研究，還是對(duì)同種細(xì)胞來源的EVs進(jìn)行研究？科技進(jìn)步需要更加細(xì)致和精密的研究，在當(dāng)前科技水平條件下，筆者傾向于后者。對(duì)于某類細(xì)胞來源的EVs（例如紅細(xì)胞來源的EVs）的分離純化需要用到特定細(xì)胞表面標(biāo)記分子的相應(yīng)抗體標(biāo)記的磁珠，用于研究或者診斷的費(fèi)用則大為增加，我們期待技術(shù)的革新和進(jìn)步。

EVs及其運(yùn)送的小分子功能涉及到表觀遺傳修飾、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和基因的表達(dá)調(diào)控等，在紅系細(xì)胞的分化和發(fā)育及成熟過程中起到關(guān)鍵作用。在紅系細(xì)胞的分化和發(fā)育及成熟過程中會(huì)釋放大量的EVs到外周血當(dāng)中，但是相關(guān)的EVs的功能研究依然很少。由于遺傳、營(yíng)養(yǎng)以及缺鐵、瘧疾、血吸蟲病、慢性腎臟病等病因?qū)е录t細(xì)胞生成、代謝或者細(xì)胞降解異常就會(huì)導(dǎo)致患者貧血。當(dāng)前貧血是一種全球性的健康問題，全球約1/3的人群貧血［26］?？梢娂t細(xì)胞生成以及貧血機(jī)制的研究是全球亟待解決的難題。給貧血患者輸注紅細(xì)胞制品是貧血治療的一種常用的臨床方法，紅細(xì)胞制品相關(guān)EVs在輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié)中的作用也逐步被揭示出來，例如鐮形紅細(xì)胞貧血患者的研究從一個(gè)側(cè)面揭示了紅細(xì)胞相關(guān)EVs參與了血管內(nèi)皮屏障、單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附功能。我們認(rèn)為可以從以下幾點(diǎn)對(duì)紅細(xì)胞相關(guān)EVs進(jìn)行深入研究將會(huì)為貧血相關(guān)機(jī)制的揭示以及貧血治療帶來突破性的技術(shù)和思路：①紅系造血相關(guān)EVs的機(jī)制研究；②炎癥性EVs的機(jī)制研究；③血液制品EVs檢測(cè)技術(shù)；④血液制品EVs質(zhì)量及其對(duì)輸血者的造血和免疫調(diào)節(jié)等。