龍珣睿，劉 玥，雷世玉，王夢(mèng)芝

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

近年來，中國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)呈現(xiàn)高速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，奶牛存欄量由1978年的48萬頭增加到2000年的456.1萬頭，2007年達(dá)到了1470萬頭[1]，截至2016年底，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)顯示我國(guó)現(xiàn)有奶牛存欄頭數(shù)約為1469×104頭[2]。因此，監(jiān)測(cè)奶牛養(yǎng)殖環(huán)境中微生物含量，評(píng)定其衛(wèi)生狀況，對(duì)牛場(chǎng)的管理具有重要指導(dǎo)意義。研究表明，規(guī)?；車h(huán)境指標(biāo)基本符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)外圍居民生活環(huán)境的影響較?。坏S便堆放區(qū)、玉米地等個(gè)別采樣點(diǎn)在部分時(shí)間點(diǎn)超出國(guó)家國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[3]。為進(jìn)一步研究奶牛場(chǎng)環(huán)境的衛(wèi)生狀況，本研究采用菌落總數(shù)測(cè)定法分別收集空氣、污水、土壤中的樣品并測(cè)定其細(xì)菌含量，對(duì)規(guī)模化奶牛場(chǎng)不同奶牛舍內(nèi)細(xì)菌含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)和比較，為進(jìn)一步改善養(yǎng)殖環(huán)境和保護(hù)生態(tài)提供一些試驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與采樣分布

本次試驗(yàn)場(chǎng)地為長(zhǎng)江中下游平原的某規(guī)模化奶牛場(chǎng)，場(chǎng)區(qū)農(nóng)牧結(jié)合，北區(qū)為種植區(qū)和污染區(qū)，南區(qū)為生產(chǎn)區(qū)和場(chǎng)前區(qū)。該地常年主導(dǎo)風(fēng)向東南風(fēng)，污染區(qū)位于生產(chǎn)區(qū)及場(chǎng)前區(qū)的下風(fēng)向。本次試驗(yàn)在牛場(chǎng)選擇了六個(gè)不同牛舍的舍內(nèi)和舍外進(jìn)行采樣，共12個(gè)點(diǎn)，分別為散養(yǎng)式牛舍、拴系式牛舍、獸醫(yī)室、產(chǎn)房、擠奶舍、犢牛舍。

1.2 采樣及細(xì)菌培養(yǎng)

1.2.1 空氣中細(xì)菌的采樣及培養(yǎng) 采用自然沉降法[3]，在當(dāng)天16:00，在各個(gè)采樣點(diǎn)打開盛有營(yíng)養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)皿蓋，將培養(yǎng)皿有營(yíng)養(yǎng)瓊脂的一面水平向上，置于高度約1.2 m處采樣6 min(室外10 min)，之后迅速送往實(shí)驗(yàn)室，置于37 ℃的溫箱培養(yǎng)24 h后取出，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)和計(jì)算。

1.2.2 土壤中細(xì)菌的采樣及培養(yǎng) 在當(dāng)天16:30，在各個(gè)采樣點(diǎn)的土壤下5 cm處取10 g左右土壤置于密封保鮮袋，采樣結(jié)束后帶回實(shí)驗(yàn)室稱重0.5 g置于5 mL離心管，加入蒸餾水至5 mL，搖勻靜置3分鐘后取上清液0.2 mL涂板。涂板后所有培養(yǎng)皿同時(shí)置于37℃的溫箱培養(yǎng)24 h后取出，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)和計(jì)算。

1.2.3 水中細(xì)菌的采樣及培養(yǎng) 采樣參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)平板菌落計(jì)數(shù)法(GB/T5750.12-2006)[4]。同在當(dāng)天17:00，用一次性滴管在采樣點(diǎn)水下5 cm處取水樣10 mL左右置于離心管，采樣結(jié)束后帶回實(shí)驗(yàn)室，吸取0.5 mL加入新的離心管，再加入4.5 mL蒸餾水，搖勻靜置3 min后取上清液0.2 mL涂板。涂板后所有培養(yǎng)皿同時(shí)置于37 ℃的溫箱培養(yǎng)24 h后取出，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)和計(jì)算。

圖1 采樣點(diǎn)分布圖※為采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling point distribution※ is sampling point

1.3 細(xì)菌數(shù)計(jì)算公式

1.3.1 空氣中細(xì)菌數(shù) C=50000×N/(A×T)[5]

式中：C為每立方米菌落總數(shù)(cfu/m3)；N為每皿菌落數(shù)(個(gè))；A為培養(yǎng)皿面積(cm2)；T為采樣時(shí)間(min)。

1.3.2 土壤中的細(xì)菌數(shù) 細(xì)菌數(shù)/g=50×平板上的菌落總數(shù)

1.3.3 水中的細(xì)菌數(shù) 細(xì)菌數(shù)/L=50 000×平板上的菌落總數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 軟件和SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和 Duncan分析，以P<0.05作為差異顯著。并進(jìn)行Person Correlation相關(guān)性分析，以Sig. (2-tailed) <0.05為顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)外空氣細(xì)菌密度比較

由圖2可知，牛場(chǎng)不同牛舍采樣點(diǎn)的空氣細(xì)菌密度大致都在104個(gè)/m3數(shù)量級(jí)水平。其中，拴系式牛舍舍內(nèi)的細(xì)菌密度最高為7.27×104個(gè)/m3，擠奶廳舍外最低為0.60×104個(gè)/m3，差異顯著(P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)空氣細(xì)菌含量均值為2.97×104個(gè)/m3；室外為0.84×104個(gè)/m3，差異顯著(P<0.05)。除獸醫(yī)室外，其余畜舍內(nèi)空氣細(xì)菌密度基本大于畜舍外，這可能是由于獸醫(yī)室更多地人工進(jìn)行和疾病相關(guān)的操作所致。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，栓系舍和產(chǎn)房的室內(nèi)細(xì)菌含量均顯著高于室外(P<0.05)。

2.2 室內(nèi)外污水細(xì)菌密度比較

由圖3可知，不同牛舍各采樣點(diǎn)污水細(xì)菌密度基本都在107個(gè)/L數(shù)量級(jí)水平。其中產(chǎn)房室內(nèi)最高達(dá)到3.50×107個(gè)/L，而產(chǎn)房舍外最低為0.19×107個(gè)/L，差異顯著(P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)污水細(xì)菌含量均值為2.72×107個(gè)/L；室外為1.39×107個(gè)/L，差異顯著(P<0.05)。除犢牛舍外，其余畜舍內(nèi)中污水細(xì)菌密度大于畜舍外(P<0.05)，而犢牛舍則相反，畜舍外污水細(xì)菌密度大于畜舍內(nèi)。這與犢牛舍和擠奶廳接近，其畜舍外受擠奶廳影響更大有關(guān)。

圖2 不同牛舍室內(nèi)外空氣細(xì)菌密度對(duì)比Fig.2 Comparison of the bacterial densities in indoor and outdoor air between cowsheds

2.3 室內(nèi)外土壤細(xì)菌菌落總數(shù)結(jié)果比較

由圖4可知，大部分牛舍室內(nèi)外土壤細(xì)菌數(shù)基本在104個(gè)/g數(shù)量級(jí)，其中，拴系式牛舍舍內(nèi)最高達(dá)到6.00×104個(gè)/g，而產(chǎn)房舍外最低為1.48×104個(gè)/g，差異顯著(P<0.05)?？傮w看來，各牛舍室內(nèi)外土壤中細(xì)菌密度基本一致，室內(nèi)均值為3.30×104個(gè)/g；室外為3.19×104個(gè)/g，無差異顯著(P>0.05)。但栓系式泌乳牛舍室內(nèi)土壤中的細(xì)菌密度高于室外，也高于其他牛舍室內(nèi)外土壤細(xì)菌數(shù)(P<0.05)，這可能由于其泌乳牛舍其奶牛在室內(nèi)的活動(dòng)量和作業(yè)量大有關(guān)。

圖4 不同牛舍室內(nèi)外土壤細(xì)菌密度總數(shù)Fig.4 Comparison of total bacterial contents in indoor and outdoor soil between the cowsheds

2.4 空氣、污水、土壤中細(xì)菌的相關(guān)性分析

進(jìn)一步數(shù)據(jù)相關(guān)性分析，得出結(jié)果如表1。從表1可知，空氣和污水相關(guān)系數(shù)r=0.631，P=0.028，表明空氣、污水的細(xì)菌數(shù)間相關(guān)顯著。

表1 空氣、污水、土壤細(xì)菌數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果Table 1 The correlation analysis on bacteria densities among air, sewage and soil

注：*為顯著性水平為<0.05(兩尾)。

Note: * Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).

3 討 論

3.1 奶牛場(chǎng)的污染狀況

史建民等[2]研究表明，離牛舍不遠(yuǎn)的區(qū)域空氣落菌所測(cè)定的各采樣點(diǎn)的細(xì)菌密度在314.4-4 244.4/m3范圍內(nèi)變化除個(gè)別采樣點(diǎn)位其他基本在國(guó)標(biāo)GB/T 18204.3-2013建議的2 500/m3以下的密度范圍內(nèi)[3]。而本試驗(yàn)大部分牛舍空氣細(xì)菌含量均在104水平，均超出了清潔所規(guī)定的細(xì)菌密度范圍，尤其是拴系式牛舍舍內(nèi)的細(xì)菌密度最高為7.27×104個(gè)/m3，完全超過畜禽場(chǎng)環(huán)境質(zhì)量及衛(wèi)生控制規(guī)范中規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)(T1167-2006畜禽場(chǎng)環(huán)境質(zhì)量及衛(wèi)生控制規(guī)范)。原因可能是冬季奶牛在室內(nèi)活動(dòng)較多，加之冬季的畜室內(nèi)又相對(duì)封閉，而造成了空氣細(xì)菌密度的增加。金蘭梅等[6]比較了冬季不同乳牛舍內(nèi)空氣中的細(xì)菌數(shù)量，舍內(nèi)細(xì)菌數(shù)量最高可達(dá)33.8×103個(gè)/m3，高玉紅等[7]在河北某奶牛舍內(nèi)測(cè)得夏季不同建筑類型的牛舍內(nèi)細(xì)菌數(shù)量平均達(dá)到27.5×103個(gè)/m3，均與本研究的結(jié)果相近。

本試驗(yàn)所測(cè)定的土壤中細(xì)菌在104數(shù)量級(jí)，相對(duì)于一般研究的1 g土壤內(nèi)含有106～109個(gè)細(xì)菌[8]來說，其潔凈程度相對(duì)較高。這可能是由于所采集土壤樣品為地表下5 cm左右，受地面的消毒影響較大所致。該奶牛場(chǎng)對(duì)于地面和走道有定期消毒的生產(chǎn)制度。而本試驗(yàn)所測(cè)定的污水中細(xì)菌總數(shù)在107數(shù)量級(jí)，可能是因?yàn)樗杉臉悠繁旧頌槲鬯约?xì)菌含量相對(duì)較高。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)該奶牛場(chǎng)空氣和污水的細(xì)菌含量間相關(guān)顯著，進(jìn)一步說明了奶牛養(yǎng)殖環(huán)境中，污水的處理狀況對(duì)空氣潔凈狀況有著直接的影響。這也是值得大部分養(yǎng)殖場(chǎng)重視的問題之一。

3.2 奶牛舍內(nèi)外的污染狀況分析

奶牛舍內(nèi)外環(huán)境空氣中的細(xì)菌來源于牛群排出的糞便、體表呼吸和運(yùn)動(dòng)所散發(fā)的微生物[9]。本研究中，空氣中細(xì)菌密度總體上舍內(nèi)大于舍外的結(jié)果，其原因可能是：奶牛在舍內(nèi)采食，排泄，休息，且舍內(nèi)空間有限，空氣流通速度慢；而舍外與大氣相連，空間寬闊，空氣流動(dòng)速度快，所以舍內(nèi)空氣細(xì)菌大于舍外。Tong等[10]研究發(fā)現(xiàn)，光照對(duì)室外細(xì)菌有明顯的致死作用，且太陽光中的紫外線對(duì)大部分細(xì)菌均有殺滅作用，一定時(shí)間內(nèi)可殺死大部分細(xì)菌[11]。舍外空氣中的細(xì)菌長(zhǎng)期暴露在陽光下，經(jīng)照射后細(xì)菌部分會(huì)被殺死，從而也使得舍內(nèi)細(xì)菌密度高于舍外。張鶴平[12]研究表明，在畜牧場(chǎng)的空氣中，由于微粒多，紫外線少，空氣流速慢以及微生物來源多等原因，使畜舍空氣中微生物往往較舍外多。

3.3 不同奶牛舍的污染狀況分析

空氣是人類和畜禽賴以生存的重要因素之一，與動(dòng)物生活最密切相關(guān)，微生物對(duì)人類和畜禽健康及生產(chǎn)性能的影響在很多情況下是通過空氣污染造成的，而空氣則能夠直接反應(yīng)其生存環(huán)境的污染狀況[13]。現(xiàn)代集約化畜禽生產(chǎn)過程中，由于動(dòng)物養(yǎng)殖密度高、空間相對(duì)狹窄，又容易使動(dòng)物舍內(nèi)外微生物氣溶膠濃度升高[14]；而且不同類型的牛舍，因?yàn)槟膛５娘曫B(yǎng)管理方式和因之的生活習(xí)性不同，其環(huán)境中的細(xì)菌含量也有一定的差異。本研究不同類型畜舍空氣中細(xì)菌含量由大到小的順序?yàn)椋核┫凳脚Ｉ?產(chǎn)房>散養(yǎng)式牛舍>擠奶廳>獸醫(yī)室>犢牛舍。其中，拴系式牛舍較密閉，奶?；顒?dòng)量大，空氣中細(xì)菌較多，而在冬季舍內(nèi)通風(fēng)相對(duì)不良，所以拴系式牛舍和產(chǎn)房的細(xì)菌總數(shù)也較高。散欄牛舍奶?；顒?dòng)相對(duì)自由，常常出入運(yùn)動(dòng)場(chǎng)，舍內(nèi)細(xì)菌也相對(duì)栓系式的為少。Dungan等[15]研究表明，散欄奶牛舍空氣中細(xì)菌數(shù)量約為102～104個(gè)/m3，本研究散欄奶牛的結(jié)果也接近其上限值。本研究中的擠奶廳、獸醫(yī)室舍和犢牛舍內(nèi)牛群密度相對(duì)小，其細(xì)菌數(shù)量也相對(duì)較少。研究表明，牛舍的空氣細(xì)菌與各牧場(chǎng)衛(wèi)生管理有很大的相關(guān)性[7]。因此，規(guī)范好奶牛場(chǎng)的衛(wèi)生管理，對(duì)保證奶牛的健康養(yǎng)殖至關(guān)重要。依據(jù)該奶牛場(chǎng)的具體情況，應(yīng)加強(qiáng)污水的處理和環(huán)境的消毒工作。另外，加強(qiáng)環(huán)境監(jiān)測(cè)與監(jiān)控力度，確保養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生狀況。

4 結(jié) 論

本研究表明，奶牛場(chǎng)牛舍室內(nèi)外的細(xì)菌含量有所不同，以室內(nèi)較高；而不同牛舍則以栓系式牛舍較高，犢牛舍相對(duì)較低。同時(shí)，空氣中的細(xì)菌數(shù)與污水中的有一定的相關(guān)性，提示要加強(qiáng)奶牛養(yǎng)殖環(huán)境中污水的處理，以保障奶牛養(yǎng)殖環(huán)境的健康。

[1] 孫玉娟,張會(huì)玲,吳慧娟.我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中存在的幾個(gè)問題[J].河北理工大學(xué)學(xué)報(bào)(社會(huì)科學(xué)版),2009,9(5):60-62.

[2] 史建民，張娜，張利宇，等.奶牛養(yǎng)殖形勢(shì)分析與發(fā)展對(duì)策[J].中國(guó)奶牛,2017(9):57-58.

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.公共場(chǎng)所衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 第3部分：空氣微生物：GB/T 18204.3-2013[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[4] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)，生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法：BG5749-2006 GB/T5750.1～5750.13-2006[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[5] WAN G H，CHUNG F F，TANG C S，et al.Long-term surveillance of air quality in medical center operating rooms[J]. Am J Infect Control,2011,39(4):302-308.

[6] 金蘭梅,伍清林,呂麗珍,等.不同乳牛舍環(huán)境空氣中細(xì)菌含量的比較研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,37(12):131-135.

[7] 高玉紅,曹玉鳳,于海川,等.不同類型肉牛舍內(nèi)外空氣中細(xì)菌含量的比較研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2013,34(2):50-52.

[8] TORSVIK V, GOKSOYR J, DAAE F L. High diversity in DNA of soil bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology, 1990,56(3),782-787.

[9] 李基棕,周碧君,嵇辛勤,等. 豬場(chǎng)環(huán)境中主要病原菌耐藥性分析[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào),2011,30(6):554-557.

[10] TONG Y, LIGHTHART B. Effect of simulated solar radiation on mixed outdoor atmospheric bacterial populations[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1998, 26(4):311-316.

[11] 劉端云,紫外線的殺菌作用[J].中華護(hù)理雜志, 1984,19(3):179-180.

[12] 張鶴平,養(yǎng)殖場(chǎng)及其周圍環(huán)境空氣中細(xì)菌播散研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[13] 伍清林,金蘭梅,葛繼文,等.乳牛舍內(nèi)環(huán)境空氣中細(xì)菌數(shù)量與乳房炎的關(guān)系研究[J].中國(guó)奶牛,2010(1):39-42.

[14] 吳彩霞,劉朝明,鄧?guó)P如,等. 規(guī)模化畜牧養(yǎng)殖對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞及防治[J].江西飼料,2008(4):10-13.

[15] DUNGAN R S, LEYTEM A B, BJORNEBERG D L. Concentrations of airborne endotoxin and microorganisms at a 10,000-cow open-freestall dairy[J]. Journal of animal science, 2011, 89(10):3 300-3 309.