鐘文強(qiáng)，孟慶玲*，喬 軍，陳 英，貢莎莎，王熙鳳，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

少孢節(jié)叢孢菌是目前研究最多的一種捕食線蟲(chóng)性真菌[1]，在自然界中廣泛分布。研究表明，幾丁質(zhì)(Chitin)是許多線蟲(chóng)體壁和蟲(chóng)卵外殼的主要成分[2]，來(lái)源于致病性真菌的幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)水解，而捕食線蟲(chóng)性真菌在侵染線蟲(chóng)過(guò)程中分泌的胞外水解酶中就含有幾丁質(zhì)酶，可能參與線蟲(chóng)表皮的侵入和宿主細(xì)胞的降解[3-6]。研究顯示，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲(chóng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-8]。從新疆地區(qū)分離到的捕食線蟲(chóng)性真菌主要為少孢節(jié)叢孢菌[9-11]，因此，對(duì)少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)及其在侵染線蟲(chóng)過(guò)程中的研究具有重要意義。

本研究根據(jù)GenBank中公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)全基因組[12]，從少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株中對(duì)幾丁質(zhì)酶基因AO-587和AO-31進(jìn)行克隆、測(cè)序，對(duì)基因及其編碼氨基酸序列的分子進(jìn)行特征性分析，并將這2個(gè)基因與致病性相關(guān)的真菌幾丁質(zhì)酶進(jìn)行同源性比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析，為進(jìn)一步研究少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲(chóng)過(guò)程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑、及培養(yǎng)基

捕食線蟲(chóng)性真菌少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1(ArthrobotrysoligosporaXJ-A1)和E.coliDH5α菌株由石河子大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室保存；2×Taq PCR 反應(yīng)試劑、5 000 bp DNA Marker均購(gòu)自索來(lái)寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、pMD19-T載體與Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。YPSSA(yeast-phosphate-sulfate-soluble starch-agar)培養(yǎng)基：0.8 g酵母提取物、0.2 g K2HPO4·3H2O、0.1 g MgSO4、4 g可溶性淀粉、4 g瓊脂，加蒸餾水至200 mL，經(jīng)高壓滅菌后傾注于滅菌玻璃培養(yǎng)皿，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

向YPSSA培養(yǎng)基中加入適量少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1，在20 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 d。取適量菌絲，用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)全基因組序列，利用Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)幾丁質(zhì)酶基因AO-587和AO-31的特異性引物：AO-587(上游)：5' ATGAAAACAATTACTATCGC 3'；AO-587(下游)：5' CTAATCATAACTAGGGGATC 3'；AO-31(上游)：5' ATGGAAGCTCAAG 3'；AO-31(下游)：5' CTACCGCTGATTTCTAA 3'，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 幾丁質(zhì)酶基因的PCR擴(kuò)增和克隆

PCR擴(kuò)增體系為20 μL：其中DNA模板2 μL、PCR Mixture 8 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 9 μL。AO-587基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 120 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。AO-31基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，62℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。得到的DNA產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。將回收的目的基因片段克隆到pMD18-T載體上，16 ℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)入到E.coliDH5α菌株中，涂布在含有100 mg/ml Amp的固體LB培養(yǎng)基上，挑單菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，提質(zhì)粒后經(jīng)PCR鑒定，將提取的質(zhì)粒交送北京六合華大股份有限公司測(cè)序。

1.5 幾丁質(zhì)酶基因及其編碼氨基酸序列生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果利用生物在線軟件ProParam (http://web.expasy.org/protparam/)計(jì)算蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等；通過(guò)(http://www.expasy.org/tools/，http://www.ebi.ac.uk/interpro/)分析幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域、氨基酸活性位點(diǎn)；通過(guò)SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；通過(guò)Predictprotein和Phyre2預(yù)測(cè)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。采用DNAMAN和MEGA5.0軟件NJ法(Neighbor-joining Method，bootstrap為1000)進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對(duì)和進(jìn)化分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1的DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果表明，少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-587基因約為1 930 bp，AO-31基因約為1 171 bp，與GenBank中已公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)AO-587和AO-31基因大小相近(圖1)。

圖1 少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶基因AO-587和AO-31的PCR擴(kuò)增M1. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL-5000；M2.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000；1-3. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification products of chitinases AO-587 and AO-31 gene of Arothrobotrys oligospora XJ-A1 by PCRM. DL-5000 DNA Marker;M2. DL-2000 DNA Marker;1-3. PCR amplified product

2.2 少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31基因及其編碼氨基酸序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，少孢節(jié)叢孢菌XJ-A1幾丁質(zhì)酶AO-587基因全長(zhǎng)為1 930 bp，與已公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)的幾丁質(zhì)酶AO-587核苷酸序列的同源性為94.43%。序列中包含4個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)1 560 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，內(nèi)含子都以GT開(kāi)頭，AG結(jié)尾，分別位于319～419、549～690、929～999、1696～1780位核苷酸，具有真菌內(nèi)含子的共同特征；外顯子編碼519個(gè)氨基酸，與已公布的氨基酸序列同源性為93.25%。通過(guò)SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-587氨基酸序列有信號(hào)肽序列，位于氨基酸序列的第1～22位。Protparam軟件預(yù)測(cè)幾丁質(zhì)酶AO-587的分子量為55.86 kD，等電點(diǎn)為4.94；Interpro和Scanprosite軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-587存在2個(gè)幾丁質(zhì)酶保守的區(qū)域SVGG和DGLDLDWE，屬于糖苷水解酶18家族，主要催化活性區(qū)域位于105～364位，并且存在一個(gè)水解酶催化活性位點(diǎn)DGLDLDWE，位于234～241位(圖2)。

AO-31基因全長(zhǎng)為1 173 bp，與已公布的少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 24927)的幾丁質(zhì)酶AO-31核苷酸序列的同源性為99.64%；序列中包含3個(gè)內(nèi)含子和一個(gè)900 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，內(nèi)含子都以GT開(kāi)頭，AG結(jié)尾，分別位于166～233、251～324、723～788位核苷酸，具有真菌內(nèi)含子的共同特征序列；外顯子編碼299個(gè)氨基酸，與已公布的氨基酸序列同源性為100% 。經(jīng)SignalP軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-31氨基酸序列沒(méi)有信號(hào)肽。Protparam軟件預(yù)測(cè)幾丁質(zhì)酶AO-31的分子量為34.6 kD，等電點(diǎn)為5.86；Interpro 和Scanprosite軟件分析發(fā)現(xiàn)，AO-31存在2個(gè)幾丁質(zhì)酶保守區(qū)域ICFVG和IRRDWEY，屬于糖苷水解酶18家族，幾丁質(zhì)酶主要催化的活性區(qū)位于10-275位，存在一個(gè)水解酶催化活性位點(diǎn)IRRDWEY，位于53～59位(圖3)。

圖2 不同真菌來(lái)源幾丁質(zhì)酶主要催化活性區(qū)域氨基酸序列比對(duì)*表示幾丁質(zhì)酶的結(jié)合區(qū)域(ENGVMDYKA，GLCCGMWWETSG)與糖基水解酶18家族保守的水解區(qū)域(SXGG，DGXDXDWE)；灰色的部分為高度同源(100%)區(qū)域Fig.2 Comparison of amino acid sequence of major catalytic active regions of chitinase from different fungi* indicates the binding region of chitinase (ENGVMDYKA, GLCCGMWWETSG) and the conserved hydrolysis zone of the sugar-based hydrolase 18 family (SXGG, DGXDXDWE)；grey part is part of the highly homologous (100%) region

2.3 幾丁質(zhì)酶二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

Predictprotein軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲(loop)、α螺旋(alpha-helix)和β折疊(beta-sheet)為結(jié)構(gòu)元件，在AO-587二級(jí)結(jié)構(gòu)中分別占17.7%、15.6%、66.7%，在AO-31二級(jí)結(jié)構(gòu)中分別占28.1%、16.4%、55.5%。SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31三級(jí)結(jié)構(gòu)都具有(α/β)8的圓桶形結(jié)構(gòu)，其外部由α螺旋形成外桶，中心部分由β折疊形成內(nèi)桶，內(nèi)外桶緊密連接(圖4)。

圖3 少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域模式圖Fig.3 Domain pattern of chitinase AO-587 and AO-31 gene encoding protein of Arthrobotrys oligospora

圖4 AO-587和AO-31幾丁質(zhì)酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig. 4 Prediction of the tertiary structures of AO-587 and AO-31 chitinase

2.5 不同物種來(lái)源幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA5.0軟件對(duì)28個(gè)不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示(圖5)，各菌株序列形成3個(gè)明顯的分枝，其中，第1個(gè)分枝的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量約為47 ku，第2個(gè)分枝的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量約為41 ku，第3個(gè)分枝的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量約為52 ku。少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株幾丁質(zhì)酶AO-31分為單獨(dú)的一個(gè)小分枝，AO-587位于第3個(gè)分枝和Drechslerellsstenobrocha以及Dactylellinahaptotyla的幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系最接近說(shuō)明他們具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。

3 討 論

目前，多種侵染性分子(毒素、胞外酶、病原物激素、病原物胞外多糖等)在捕食線蟲(chóng)性真菌——線蟲(chóng)相互作用的過(guò)程中被先后發(fā)現(xiàn)，尤其是絲氨酸蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在侵入線蟲(chóng)表皮和降解宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3-8]。有關(guān)捕食線蟲(chóng)性真菌產(chǎn)生胞外蛋白酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究于20世紀(jì)80年代才開(kāi)始出現(xiàn)[14]，之后對(duì)蛋白酶基因的研究較多，而國(guó)內(nèi)外對(duì)捕食線蟲(chóng)性真菌幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因的報(bào)道卻比較少。少孢節(jié)叢孢菌(Arthrobotrysoligospora)是捕食線蟲(chóng)性真菌的代表菌[1]，在自然界中廣泛分布。現(xiàn)有研究資料表明，少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲(chóng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-8]。幾丁質(zhì)(Chitin)是許多線蟲(chóng)體壁和蟲(chóng)卵外殼的主要成分，是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖以β-1, 4糖苷鍵連接而成的高分子生物多聚體，而幾丁質(zhì)酶能催化幾丁質(zhì)β-1, 4糖苷鍵水解[2]。因此，研究少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶在侵染線蟲(chóng)過(guò)程中發(fā)揮的作用具有重要意義。

本研究以捕食線蟲(chóng)真菌的模式菌-少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-A1為研究對(duì)象，對(duì)少孢節(jié)叢孢幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31進(jìn)行克隆，成功獲得兩個(gè)全長(zhǎng)編碼基因序列，與少孢節(jié)叢孢菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 24927)的幾丁質(zhì)酶AO-587和AO-31基因核苷酸序列同源性分別為94.43%、99.64%，氨基酸序列同源性分別為93.25%和100%。可知不同分離株的捕食線蟲(chóng)性真菌少孢節(jié)叢孢菌之間存在一定的差異?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)不同來(lái)源真菌的幾丁質(zhì)酶具有相似的幾丁質(zhì)酶催化域、信號(hào)肽、幾丁質(zhì)結(jié)合域等結(jié)構(gòu)域[13,15-16]。本研究利用Interpro和Scanprosite軟件進(jìn)行幾丁質(zhì)酶AO-587、AO-31氨基酸序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，AO-587的幾丁質(zhì)酶主要催化活性區(qū)域位于105～364位，AO-31的幾丁質(zhì)酶主要催化活性區(qū)位于10～275位。并且XJ-A1幾丁質(zhì)酶均具有典型的幾丁質(zhì)酶催化區(qū)保守序列SXGG和DGXDXDWE，與Wright等[17]和Cantarel等[18]的研究結(jié)果一致。從幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析可以看出，少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株幾丁質(zhì)酶AO-587、AO-31和Drechslerellsstenobrocha以及Dactylellinahaptotyla的幾丁質(zhì)酶親緣關(guān)系最接近。目前，在Drechslerellsstenobrocha以及Dactylellinahaptotyla中已報(bào)道有多種糖苷水解酶18家族幾丁質(zhì)酶或假定的幾丁質(zhì)酶基因[21]，參考這些在進(jìn)化上存在相關(guān)性的幾丁質(zhì)酶將更有利于深入開(kāi)展少孢節(jié)叢孢菌相關(guān)幾丁質(zhì)酶功能研究。

圖5 不同真菌來(lái)源幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)*為新疆分離株少孢節(jié)叢孢菌幾丁質(zhì)酶AO-31、AO-587Fig.5 Phylogenetic tree of chitinase from different fungi sources* means the Xinjiang isolates, respectively, and the chitinase AO-31 and AO-587

新疆是我國(guó)主要的牧區(qū)，家畜線蟲(chóng)病對(duì)新疆養(yǎng)羊業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。采取化學(xué)藥物防控該病時(shí)產(chǎn)生的抗藥性、藥物殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題日益嚴(yán)重，利用寄生性線蟲(chóng)的天敵-捕食線蟲(chóng)性真菌進(jìn)行生物防治具有良好的應(yīng)用前景，因此開(kāi)展捕食線蟲(chóng)性真菌的研究至關(guān)重要。隨著對(duì)少孢節(jié)叢孢菌胞外蛋白酶分子生物學(xué)研究的深入，為研究和開(kāi)發(fā)基于其胞外蛋白酶(幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶)的生物防控制劑提供科學(xué)依據(jù)。

[1]NORDBRING-HERTZ B, JANSSON H B, TUNLID A. Nematophagous fungi[J]. John Wiley & Sons,2001,51(7):157-163.

[2] BARTNICKI-GARCIA S. Cell wall chemistry, morphogenesis, and taxonomy of fungi[J]. Annual Review of Microbiology, 1968, 22(1): 87-108.

[3] LI Juan, YU Li, YANG Jinkui, et al. New insights into the evolution of subtilisin-like serine protease genes in Pezizomycotina[J]. BMC Evolutionary Biology, 2010, 10(1): 68-82.

[4] ANDERSSON K M, MEERUPATI T, LEVANDER F, et al. Proteome of the Nematode-Trapping cells of the fungus monacrosporium haptotylum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(16): 4 993-5 004.

[5] GAN Zhongwei, YANG Jinkui, TAO Nan, et al. Cloning and expression analysis of a chitinase gene Crchi1 from the mycoparasitic fungus Clonostachys rosea (syn. Gliocladium roseum)[J]. Journal of Microbiology (Seoul, Korea), 2007, 45(5): 422-430.

[6] YANG Jinkui, GAN Zhongwei, LOU Zhiyong, et al. Crystal structure and mutagenesis analysis of chitinase CrChi1 from the nematophagous fungus Clonostachys rosea in complex with the inhibitor caffeine[J]. Microbiology (Reading, England), 2010, 156(Pt 12): 3 566-3 574.

[7]TIFFIN P. Comparative evolutionary histories of chitinase genes in the Genus zea and Family poaceae[J]. Genetics, 2004, 167(3): 1 331-1 340.

[8] NORDBRING-HERTZ B. Morphogenesis in the nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora-an extensive plasticity of infection structures[J]. Mycologist, 2004, 18(03): 125-133.

[9] 王為升. 捕食線蟲(chóng)性真菌的分離鑒定及高效菌株的篩選[D].新疆石河子：石河子大學(xué),2013.

[10] 陳雙慶. 捕食線蟲(chóng)性真菌的分離鑒定及少孢節(jié)叢孢菌黏附分子與線蟲(chóng)相互作用初步研究[D].新疆石河子：石河子大學(xué),2014.

[11] ZHAO Hailong, QIAO Jun, MENG Qingling, et al. Expression of serine proteinase P186 of Arthrobotrys oligospora and analysis of its nematode-degrading activity[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 2015, 108(6): 1 485-1 494.

[12] YANG Jin-kui, WANG Lei, JI Xing-lai, et al. Genomic and proteomic analyses of the fungus arthrobotrys oligospora provide insights into Nematode-Trap formation[J]. PLOS Pathogens, 2011, 7(9): e1002179.

[13] 趙海龍. 少孢節(jié)叢孢菌胞外蛋白酶基因的克隆, 表達(dá)及生物學(xué)活性研究[D]. 新疆石河子：石河子大學(xué), 2015.

[14] SCHENCK N C, KINLOCH R A. Incidence of mycorrhizal fungl on 6 field crops in monoculture on a newly cleared woodland site[J]. Mycologia, 1980, 72(3): 445-456.

[15] 馮俊麗，朱旭芬．微生物幾丁質(zhì)酶的分子生物學(xué)研究[J]．浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2004，30(1)：102-108．

[16] PHILLIPS D C. The hen egg-white lysozyme molecule[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1967, 57(3): 483-495.

[17] WRIGHT H T, SANDRASEGARAM G, WRIGHT C S. Evolution of a family of N-acetylglucosamine binding proteins containing the disulfide-rich domain of wheat germ agglutinin[J]. Journal of Molecular Evolution, 1991, 33(3): 283-294.

[18] CANTAREL B L, COUTINHO P M, RANCUREL C, et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for glycogenomics[J]. Nucleic Acids Research, 2009, 37(Database issue): D233-D238.

[19] JORIS B, ENGLEBERT S, CHU C-P, et al. Modular design of the Enterococcus hirae muramidase-2 and Streptococcus faecalis autolysin[J]. FEMS Microbiology Letters, 1992, 70(3): 257-264.

[20] ANDRE G, LEENHOUTS K, HOLS P, et al. Detection and localization of single LysM-peptidoglycan interactions[J]. Journal of Bacteriology, 2008, 190(21): 7 079-7 086.

[21] SMITS G J, VAN DEN ENDE H, KLIS F M. Differential regulation of cell wall biogenesis during growth and development in yeast[J]. Microbiology (Reading, England), 2001,147(4):781-794.