鄧 雯，呂瓊霞，劉玉梅，陳曉光，馬彥博

(河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003)

檸檬酸作為畜禽的飼料酸味劑和促生長劑，雖然能夠提高畜禽胃腸酶活性，促進鈣、磷和蛋白質(zhì)的消化，促進豬或肉雞的生長[1-3]，降低料肉比[1,4]，有利于豬的早期斷奶[5]。但是，過多的外源性檸檬酸攝取也會給動物帶來不利的影響。研究表明，小鼠口服每千克體重1～2 g檸檬酸能夠降低脂多糖誘導的氧化應激，減少腦組織脂質(zhì)過氧化和炎癥，以及肝臟損傷和DNA的斷裂，每千克體重口服4 g檸檬酸時，肝臟細胞的損傷作用及DNA的斷裂加強[6]；另有研究顯示，小鼠體內(nèi)過多的檸檬酸會致肝臟細胞胞質(zhì)空泡化、細胞核膜內(nèi)陷和肝細胞壞死，細胞間膠原纖維增生[7]；大鼠每千克體重飼喂1.250 g檸檬酸，會致腎小球增生及腎小管上皮細胞粗顆粒變性[8]。肉雞日糧中添加12.5～50 g/kg檸檬酸時，肝臟等組織細胞有明顯損傷[9]，家兔長時間采食添加檸檬酸(約5%)的日糧，睪丸管周會產(chǎn)生少量纖維化，間質(zhì)輕微玻璃樣變性[10]。體外研究表明，重組中國倉鼠卵巢細胞(CHO)批量培養(yǎng)過程中，檸檬酸明顯抑制CHO的生長，阻礙細胞DNA的合成，使更多細胞發(fā)育阻滯在G1期，從而抑制細胞增殖[11]。在體情況下，檸檬酸對動物卵巢結構和卵泡發(fā)育的影響未見報道。本研究通過對小鼠進行腹腔注射檸檬酸，觀察檸檬酸對卵泡的發(fā)育和卵巢組織學形態(tài)結構的變化，探索性研究檸檬酸對雌性動物生殖性能的影響，為養(yǎng)殖業(yè)檸檬酸的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用雌性小鼠為昆明系清潔級， 購自河南科技大學醫(yī)學院。檸檬酸(AR，成都科龍化工試劑廠)；氯化鈉(AR，洛陽市化學試劑廠)；10%的中性福爾馬林溶液、無水乙醇、二甲苯(AR，萊陽市雙雙化工有限公司)； 液體石蠟(CP，北京化學試劑三廠)；HE染液(上海滬峰化工有限公司)；切片石蠟、蛋白甘油、中性樹膠(上海標本模型廠)，CX-31型數(shù)碼顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及切片制作 將20～22 g小鼠60只，隨機分為4組，每組15只。分別為對照組和檸檬酸處理組。各組每天每只小鼠分別腹腔注射0.2 mL的0.9%生理鹽水或7.5 mg/mL、15 mg/mL、30 mg/mL檸檬酸(1/12，1/6，1/3 LD50)。

在第21天，每組分別取10只小鼠處死，摘取卵巢浸泡于4%的甲醛溶液中固定24 h，制作常規(guī)石蠟切片。采用蘇木精伊紅染色(HE)。用數(shù)碼顯微鏡系統(tǒng)觀察組織切片的形態(tài)學特征，并拍攝樣片。

1.2.2 觀察的指標 本研究卵泡發(fā)育階段的分類方法參考已有文獻[17]。原始卵泡定義為：卵母細胞周圍有一層扁平卵泡細胞的卵泡。初級卵泡定義為：卵泡直徑為20 μm左右，卵母細胞周圍有一層立方細胞或多數(shù)為立方、少量扁平卵泡細胞的卵泡。次級卵泡定義為：卵泡直徑為50 μm左右，卵母細胞周圍有多于一層立方卵泡細胞的無腔卵泡。有腔卵泡包括：早期有腔卵泡，顆粒細胞層局部開始出現(xiàn)腔隙的卵泡。有腔卵泡，顆粒細胞層出現(xiàn)清晰腔隙的卵泡。排卵前卵泡(成熟卵泡)，卵泡直徑=200 μm，卵母細胞周圍圍繞有許多卵丘顆粒細胞的卵泡。隨機選取不同檸檬酸劑量處理組21 d的卵巢切片5張，觀察所有不同階段的卵泡形態(tài)學變化，選取典型病變拍照。

2 結 果

2.1 各種卵泡的細胞形態(tài)顯微結構特征

2.1.1 原始卵泡 由圖1可見，對照組大多數(shù)原始卵泡位于卵巢皮質(zhì)淺層，原始卵泡數(shù)量較多，單個或三兩成群地分布在靠近白膜的皮質(zhì)淺層，分布不均勻，由一層扁平的卵泡細胞和一個未分化卵母細胞組成。卵泡細胞染色深，緊貼卵母細胞，細胞核大而圓，核內(nèi)異染色質(zhì)少，核仁大而明顯。見圖1a小箭頭所示。

圖1 檸檬酸對卵巢不同類型發(fā)育卵泡形態(tài)的影響a-c.對照組；d-f. 低劑量檸檬酸組；g-l.中劑量檸檬酸組；m-r.高劑量檸檬酸組Fig. 1 The influence of citric acid on morphological changes in different types of ovarian folliculara-c. control;d-f. low dose citric acid group；g-l. medium dose citric acid group；m-r. high dose citric acid group

2.1.2 初級卵泡 多位于皮質(zhì)淺部，由單層柱狀或單層立方卵泡細胞包圍。卵母細胞體積有所增大，卵泡外圍開始形成結締組織的卵泡膜，透明帶開始形成但很薄、且不完整。見圖1a大箭頭所示。

2.1.3 次級卵泡 隨著卵泡的發(fā)育卵泡膜明顯增厚、分化形成內(nèi)膜細胞及外膜細胞兩層。卵母細胞迅速增大，完整的透明帶形成，位于卵泡內(nèi)壁上的卵泡細胞變成立方或柱狀后迅速增殖、密集排列成2～3 層以上的顆粒細胞層，顆粒細胞間雖有空隙，但未出現(xiàn)明顯的卵泡腔(圖1b)。

2.1.4 有腔卵泡 隨著卵泡腔逐漸擴大，卵母細胞包圍在一團顆粒細胞中，被擠向一邊形成卵丘。卵母細胞圓形、核大而圓，核仁清晰可見；透明帶增厚，染色后呈深紅色；顆粒細胞層數(shù)在4層以上、排列緊密，分其泌的液體使顆粒細胞之間分離，形成不規(guī)則的卵泡腔(圖1c)。卵丘細胞和卵母細胞間有細胞縫隙連接，可以傳遞各種細胞因子和信號，調(diào)節(jié)卵母細胞的減數(shù)分裂和成熟等過程。

2.1.5 卵泡膜 發(fā)育良好的卵泡，卵泡內(nèi)膜和外膜清晰、完整，有較多的血管存在，外膜細胞呈長梭形，內(nèi)膜細胞為圓形細胞或梭形，排列緊密，顆粒細胞發(fā)育良好，排列緊密(圖2a)。發(fā)育不良的卵泡，卵泡膜變薄、血管數(shù)量減少，內(nèi)膜與顆粒層細胞無明顯分界、細胞數(shù)量減少、排列松散(圖2b)箭頭所示。

2.2 檸檬酸對卵泡中各類細胞形態(tài)顯微結構的影響

2.2.1 檸檬酸對原始卵泡和初級卵泡細胞形態(tài)的影響 檸檬酸低劑量組原始卵泡、初級卵泡發(fā)育正常(圖1d)箭頭所示；中劑量組原始卵泡、初級卵泡細胞形態(tài)發(fā)育正常(圖1g)；高劑量組小鼠的卵巢中較難觀察到原始卵泡和初級卵泡。

2.2.2 檸檬酸對次級卵泡細胞形態(tài)的影響 檸檬酸低劑量組大多數(shù)次級卵泡多發(fā)育基本正常，個別卵母細胞略有收縮、呈現(xiàn)退化傾向(圖1d)▲所示。中劑量組次級卵泡異常發(fā)育的數(shù)量增加，但形態(tài)變化不一。卵泡內(nèi)外膜細胞分化正常、卵泡膜清晰、完整，卵泡的顆粒細胞發(fā)育正常，顆粒細胞局部細胞間呈現(xiàn)裂隙時，卵母細胞發(fā)育均正常(圖1j)；卵泡膜界限清晰、完整，但卵泡內(nèi)膜細胞分化較弱、細胞數(shù)量較少，卵泡層可見少量血管，此種卵泡雖然顆粒細胞發(fā)育及形態(tài)雖然正常，顆粒層細胞層數(shù)即使多至7～9層以上時顆粒層仍難見有細胞空隙出現(xiàn)，更無清晰的卵泡腔形成，但卵母細胞發(fā)育正常(圖1i、圖2e)；卵泡膜僅有外層卵泡膜細胞，卵泡內(nèi)膜細胞未分化形成，卵泡顆粒細胞數(shù)量減少、排列松散時，卵泡卵母細胞多呈現(xiàn)退化消失，透明帶皺縮、折疊(圖2f)△所示；含2～3層顆粒細胞的卵泡發(fā)育異常時，多表現(xiàn)為卵母細胞局部與顆粒層細胞分離，且退化、縮小(圖1h)。高劑量組偶見發(fā)育正常的小次級卵泡(圖1m)，所有較大的次級卵泡多表現(xiàn)為不同的閉鎖狀態(tài)。

2.2.3 檸檬酸對有腔卵泡細胞形態(tài)的影響 檸檬酸低劑量組有較多的小的有腔卵泡發(fā)育不正常，卵母細胞退化，卵丘細胞數(shù)量減少或消失，卵丘基部有較多的顆粒細胞凋亡(圖1e)；卵母細胞發(fā)育基本正常的大有腔卵泡，卵泡膜內(nèi)含有較多的血管，內(nèi)膜和外膜清晰、完整，內(nèi)膜細胞排列緊密、但圓形細胞數(shù)量減少，梭形細胞數(shù)量增加。此種卵泡的顆粒細胞排列雖緊密，但卵泡腔側顆粒細胞及卵泡細胞的基膜部分呈現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，部分顆粒細胞脫落入卵泡腔，卵丘基部有顆粒細胞凋亡(圖1f、圖2c)；發(fā)育不正常的有腔卵泡，卵丘顆粒細胞排列松散，部分顆粒細胞脫落，卵母細胞退化、變形，卵泡膜細胞層退化、變薄，內(nèi)膜細胞基本消失，卵泡膜層難見血管存在(圖2d)。中劑量組發(fā)育基本正常的卵泡，若卵泡膜清晰、完整，但卵泡膜內(nèi)膜細胞數(shù)量和卵丘基部顆粒細胞數(shù)量減少、細胞排列松散時，卵母細胞形態(tài)異于正常的圓形，多呈現(xiàn)輕微變形或出現(xiàn)退化趨勢(圖1l)；大的有腔卵泡如果卵泡膜內(nèi)層細胞顯著退化、數(shù)量減少，卵泡膜層變薄、不完整，與結締組織和顆粒細胞的界限不清晰，卵泡膜層內(nèi)無血管存在，卵丘細胞數(shù)量及層數(shù)減少或消失，顆粒細胞排列松散，則卵母細胞退化較早(從壁層顆粒細胞層數(shù)判斷)、且退化明顯(圖1k)；較多的有腔卵泡主要表現(xiàn)為卵泡膜不完整、界限不清，或卵泡膜內(nèi)膜細胞和卵丘細胞退化消失，而壁層顆粒細胞卵泡腔側可見大量核濃集的凋亡顆粒細胞，卵母細胞則已退化消失(圖2f)☆所示卵泡。高劑量組有腔卵泡的形態(tài)學改變多表現(xiàn)為不同的閉鎖狀態(tài)。閉鎖的卵泡多表現(xiàn)為：透明帶皺縮，卵母細胞退化、變形或消失，卵泡膜內(nèi)膜細胞數(shù)量減少、或轉化為梭形細胞，內(nèi)膜細胞間及卵泡膜外膜與卵泡周圍結締組織連接減弱，組織切片制作時易出現(xiàn)裂隙；顆粒細胞排列松散或分離，卵泡腔基膜斷裂，部分卵泡細胞、顆粒細胞脫落入卵泡腔(圖1n-r、圖2g、圖2h)。

圖2 檸檬酸對卵巢內(nèi)卵泡膜細胞及顆粒細胞形態(tài)的影響a-b. 對照組；c-d. 低劑量檸檬酸組；e-f.中劑量檸檬酸組；g-h. 高劑量檸檬酸組Fig. 2 The influence of citric acid on morphological changes in ovarian theca cells and granular cellsa-c. control;d-f. low dose citric acid group；g-l. medium dose citric acid group；m-r. high dose citric acid group

3 討 論

卵泡中的卵泡膜細胞、顆粒細胞和卵母細胞的功能及其相互作用與甾體激素合成、卵泡發(fā)育與閉鎖密切相關。早期的卵泡發(fā)育與卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞緊密相關[12]。在初級卵泡發(fā)育的過程中，卵母細胞和顆粒細胞間的間隙連接形成，有利于細胞間的營養(yǎng)成分、離子和信號傳導分子等進行交換[13]。次級卵泡中的卵母細胞與顆粒細胞間隙連接處存在的間隙連結蛋白(connexin37)在卵母細胞的分裂和顆粒細胞的增殖調(diào)控中具有重要作用。缺乏connexin37的小鼠卵泡雖然卵母細胞、透明帶和顆粒細胞形態(tài)都正常，但卵母細胞既不能成熟分裂，也不能調(diào)控顆粒細胞促黃體素受體、類固醇激素的合成，以及顆粒細胞的分裂增殖[13]。

卵泡膜功能性膜細胞層的形成是卵泡早期發(fā)育的生理學過程[14]，源于顆粒細胞的信號物質(zhì)可以促進卵泡基膜細胞向膜細胞的分化，并促進卵巢皮質(zhì)的基膜細胞獲得對LH的應答能力，從而促進卵泡的發(fā)育[15]。當膜細胞與顆粒細胞共培養(yǎng)時，膜細胞且具有合成雄激素的活性；當膜細胞單獨培養(yǎng)時，雄激素生成量減少[16]。隨著次級卵泡的發(fā)育開始分化出卵泡膜的內(nèi)、外兩層膜細胞，卵泡膜細胞層發(fā)生血管化，這些血管通過基底膜為顆粒細胞和卵母細胞提供營養(yǎng)和血液中卵巢調(diào)控因子，卵泡內(nèi)膜細胞分泌的雄激素以旁分泌的形式擴散至顆粒細胞間，在卵泡發(fā)育和卵泡的閉鎖調(diào)控中具有重要作用[17]。顆粒細胞能產(chǎn)生芳香化酶，催化雄激素轉化為雌激素促進顆粒細胞的有絲分裂和卵泡的生長，且能產(chǎn)生多種生長因子調(diào)節(jié)促性腺激素對卵泡的作用[15]。只有雌激素量合成高、FSH受體多的優(yōu)勢卵泡才能發(fā)育為成熟卵泡，而其余雌激素合成量低、FSH受體數(shù)少的卵泡趨向閉鎖[18]。卵泡閉鎖是通過細胞凋亡方式實現(xiàn)的，細胞凋亡發(fā)生于卵泡發(fā)育的每個階段，在早期閉鎖的卵泡中發(fā)現(xiàn)，凋亡細胞首先出現(xiàn)于顆粒細胞，隨絕大部分顆粒細胞凋亡整個卵泡發(fā)生閉鎖[19]。

在檸檬酸對卵泡中各類細胞形態(tài)的影響中，顆粒細胞或卵母細胞產(chǎn)生的諸多形態(tài)異常時，均伴隨有卵泡膜層的形態(tài)異常。卵泡內(nèi)膜細胞分化阻滯和卵泡膜層血管形成的抑制，可能是檸檬酸造成次級卵泡發(fā)育及其內(nèi)所含的各類細胞形態(tài)異常的主要原因；而有腔卵泡中顆粒細胞的形態(tài)異?；虻蛲龅陌l(fā)生，以及卵母細胞結構的退化或消失，可能主要源于卵泡內(nèi)膜細胞的退化和卵泡膜層血管的消失。研究表明，檸檬酸不但能夠抑制間期細胞DNA的復制，使更多的細胞捕獲在G1或G2期，造成細胞的分裂增殖抑制[11-20]，還能夠降低小鼠肝臟、腎臟、睪丸組織細胞抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性，增加組織細胞的氧化應激，造成細胞的氧化損傷，導致不同組織細胞的形態(tài)學改變[21-23]，并且誘導腎臟[21]、肝臟[22]、睪丸細胞[24]及癌細胞凋亡[25-26]。此外還能夠顯著抑制血管生成，減少血管分支，使小血管變短[27]。因此，檸檬酸對卵泡發(fā)育和卵泡各類細胞形態(tài)的影響機制概括而言可能有如下幾個方面。首先，通過影響細胞分裂周期導致卵泡內(nèi)各類細胞的分裂增殖抑制；其次，通過影響體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)酶的活性，導致卵泡內(nèi)各類細胞的氧化損傷；第三，通過凋亡機制導致卵泡內(nèi)各類細胞的形態(tài)改變，最終導致細胞功能和結構的退化，直至消失；第四，由于卵泡內(nèi)膜細胞的退化及卵泡膜層血管的消失，導致卵泡內(nèi)各類細胞的營養(yǎng)供應障礙和激素調(diào)控減弱或失衡。

4 結 論

研究結果表明，小鼠在低、中劑量檸檬酸暴露下對卵巢原始卵泡和初級卵泡的影響較小。低劑量檸檬酸主要導致有腔卵泡的各類細胞組織形態(tài)異常；中劑量檸檬酸主要影響次級卵泡和有腔卵泡發(fā)育與細胞組織形態(tài)結構；高劑量檸檬酸能夠?qū)е滤蓄愋偷穆雅莓a(chǎn)生閉鎖。

[1] SURYANARAYANA M,SURESH J,Rajasekhar M.A study on the associated effect of probiotic and citric acid on the performance of pre-weaned piglets[J].Tamilnadu J.Veterinary & Animal Sciences, 2012,8(3):126-130.

[2] KHODAMBASHI E N,ZAFARI NAEINI S, RUIZ-FERIA C A.Growth performance, digestibility, immune response and intestinal morphology of male broilers fed phosphorus deficient diets supplemented with microbial phytase and organic acids[J].Livestock Science, 2013,157(2-3):506-513.

[3] BOLING S D,WEBEL D M,MAVROMICHALIS I,et al.The effects of citric acid on phytate-phosphorus utilization in young chicks and pigs[J].Journal of Animal Science, 2000,78(3):682-689.

[4] DEHGHANI-TAFTI N, JAHANIAN R.Effect of supplemental organic acids on performance, carcass characteristics, and serum biochemical metabolites in broilers fed diets containing different crude protein levels[J]. Animal Feed Science and Technology,2016,211:109-116.

[5] LIU S T,HOU W X,CHENG S Y,et al.Effects of dietary citric acid on performance, digestibility of calcium and phosphorus, milk composition and immunoglobulin in sows during late gestation and lactation[J].Animal Feed Science and Technology, 2014,191:67-75.

[6] ABDEL-SALAM O M，YOUNESS E R，MOHAMED N A，et al.Citric acid effects on brain and liver oxidative stress in lipopolysaccharide-treated mice[J].Journal of Medicinal Food,2014,17(5):588-98.

[8] ABD-AlGADIR M I,IHAIMER M M,SABAH-ELKHIER M K,et al.Effect of benzoic acid and combination of benzoic with citric acid as food additives on the renal function of experimental rats[J].Asian Journal of Clinical Nutrition,2009,1(2):83-87.

[10] PACKMAN E W, ABBOTT D D, HARRISSON J W E.Comparative subacute toxicity for rabbits of citric, fumaric and tartaric acids[J].Toxicology and Applied Pharmacology,1963,5(2):163-167.

[11] 黃劍峰,張元興,張立.檸檬酸對CHO細胞生長和代謝的影響[J].華東理工大學學報(自然科學版),2006, 32(5):556-560.

[12] ORISAKA M,TAJIMA K,TSANG B K,et al.Oocyte-granulosa-theca cell interactions during preantral follicular development[J].Journal of Ovarian Research, 2009,2 (1):1-7.

[13] SIMON A M, GOODENOUGH D A,Li，et al.Female infertileity in mice lacking connexin37[J].Nature,1997,385(6616):525-529．

[14] MAGOFFIN D A.Ovarian theca cell[J].International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2005, 37 (7):1 344-1 349.

[15] ORISAKA M, MIZUTANI T,TAJIMA K,et al.Effects of ovarian theca cells on granulosa cell differentiation during gonadotropin-independent follicular growth in cattle[J].Molecular Reproduction & Development,2006,73(6):737-744.

[16] KOTSUJI F,KAMITANI N,GOTO K,et a1.Bovine theca and granulose cell interactions modulate their growth,morphology,and function[J].Biology of Reproduction,1990,43(5):726-732．

[17] WANG H,ANDOH K,HAGIWARA H,et al.Effect of adrenal and ovarian androgens on type 4 follicles unresponsive to FSH in immature mice[J].Endocrinology,2001,142 (11) :4 930-4 936.

[18] MIRO F,SMYTH C D,HILLIER S G.Development-related effects of recombinant activating steroid synthesis in rat granulose cells [J]．Endocrinology,1991,129(6):3 388-3 394．

[19] MATSUDA-MINEHATA F, INOUE N,GOTO Y, et al.The regulation of ovarian granulosa cell death by pro- and anti-apoptotic molecules [J].Journal of Reproduction and Development, 2006,52(6): 695-705.

[20] YING T H, CHEN C W, HSIAO Y P,et al.Citric Acid Induces Cell-cycle Arrest and Apoptosis of Human Immortalized Keratinocyte Cell Line (HaCaT) via Caspase-and Mitochondrial-dependent Signaling Pathways[J]. Anticaner research,2013,33(10):4 411-4 420.

[21] CHEN X G，LV Q X，LIU Y M,et al.Effects of the food additive, citric acid, on kidney cells of mice[J]. Biotechnic & Histochemistry, 2015, 90(1): 38-44.

[22] CHEN X G,LV Q X,LIU Y M,et al.Study on injury effect of food additive citric acid on liver tissue in mice[J]. Cytotechnology,2014,66(2):2 752-2 782.

[23] 張鵬飛,呂瓊霞,劉玉梅，等.檸檬酸對小鼠睪丸組織抗氧化酶活性的影響[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(8):115-118.

[24] CHEN X G,DENG W,LIU Y M,et al.Study of antagonism of citric acid on aluminum-induced toxicity in mice testis cells[J]. Molecular & Cellular Toxicology,2014,10 (4):443-450.

[25] XIONG Y , JIANG W,SHEN Y,et al. A Poly(gamma, L-glutamic acid)-citric acid based nanoconjugate for cisplatin delivery[J].Biomaterials,2012,33(29):7 182-7 193.

[26] WANG T A,ZHANG X D,GUO X Y.3-Bromopyruvate and sodium citrate target glycolysis, suppress survivin, and induce mitochondrial-mediated apoptosis in gastric cancer cells and inhibit gastric orthotopic transplantation tumor growth[J].Oncology Reports,2016,35(3):1 287-1 296.

[27] El SAYED S M,ABOU EI-MAGD R. M,SHISHIDO Y,et al.D-Amino acid oxidase-induced oxidative stress, 3-bromopyruvate and citrate inhibit angiogenesis, exhibiting potent anticancer effects[J].Journal of Bioenergetics & Biomembranes,2012,44(5):513-523.