孟 丹，孟慶玲，喬 軍*，彭葉龍，李重陽(yáng)，才學(xué)鵬，陳創(chuàng)夫

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003； 2. 阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆 阿克蘇 843000；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046)

奶牛臨床型乳房炎是影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展最主要的疾病之一，而金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)又是引起奶牛臨床型乳房炎最主要的病原菌之一[1]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是一種引起人類(lèi)感染的重要病原，它能移居和感染不同動(dòng)物。由于其流行范圍廣、感染部位多、多重耐藥等已給臨床防治帶來(lái)巨大的困難[2-3]。近年來(lái)，隨著在畜牧業(yè)大量、廣泛使用抗菌藥物，造成動(dòng)物源性SA耐藥菌株不斷增多，多重耐藥性嚴(yán)重。動(dòng)物源性耐藥細(xì)菌和耐藥基因還可以通過(guò)食物鏈傳給人類(lèi)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康[4-6]。金黃色葡萄球菌對(duì)抗抗菌藥物主要依賴(lài)于其自身攜帶的各種耐藥相關(guān)基因，由于各抗生素耐藥基因所編碼的蛋白不同，從而表現(xiàn)出不同的耐藥表型[7-8]。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物源MRSA流行株不斷出現(xiàn)，為了明確其傳播途徑和流行環(huán)節(jié)，追蹤動(dòng)物源食品中主要污染源以及研究MRSA在人與動(dòng)物之間的傳播機(jī)制，對(duì)MRSA菌株的耐藥表型、耐藥基因及分子特征進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析已成為合理使用抗菌藥物的急迫解決的問(wèn)題。1998年,Maiden等[9]建立了多位點(diǎn)測(cè)序分型(multilocussequencetyping，MLST) 技術(shù)，該技術(shù)以分析管家基因的序列多態(tài)性為基礎(chǔ)。而多位點(diǎn)序列分型(MLST)具有統(tǒng)一、標(biāo)準(zhǔn)化的全球流行病學(xué)資料，適合長(zhǎng)期大范圍的流行病學(xué)研究[10-11]。本研究旨在通過(guò)對(duì)MRSA新疆流行株耐藥表型、耐藥基因的檢測(cè)及MLST分型來(lái)分析MRSA流行株的分子流行病學(xué)特征，為防控MRSA在人畜間的流行以及指導(dǎo)臨床獸醫(yī)正確使用抗菌藥具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Baird-Parker培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌 (E.coli) DH5α菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、pMD19-T載體，DNA Marker、均購(gòu)自TaKaRa公司；生化鑒定管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；抗菌藥物紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自諾維森(北京)生物科技有限公司。

1.2 奶牛乳樣品的采集

從新疆五家渠、石河子、沙灣、瑪納斯4個(gè)地區(qū)的規(guī)模化奶牛場(chǎng)分別采集臨床型乳房炎牛乳樣品221份，采集時(shí)溫水清洗乳房并使用75%酒精棉球?qū)θ轭^進(jìn)行消毒處理，收集第3把奶后的奶樣放于滅菌的試劑管中，置于冰盒中，運(yùn)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3 分離鑒定

將采集的奶牛乳樣接種于Baird-Parker培養(yǎng)基，放于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～48 h。挑取具有典型特征的單菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)。對(duì)純化菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。隨機(jī)選取分離株用SA成套生化鑒定管測(cè)定其生化反應(yīng)特性，根據(jù)GenBank中已公布的金黃色葡萄球菌16SrRNA的序列設(shè)計(jì)通用引物，對(duì)SA分離株進(jìn)行16SrRNA序列比對(duì)分析，鑒定分離株為金黃色葡萄球菌。將分離的金黃色葡萄球菌在BHI肉湯中37 ℃培養(yǎng)24 h，再將500 μL所得新鮮菌液加入到500 μL 40%甘油中震蕩混合均勻制成20%甘油菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥敏試驗(yàn)及MRSA確證方法

用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于BHI培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)20～24 h，再用滅菌生理鹽水將細(xì)菌濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，?00 μL均勻涂布于MHA培養(yǎng)基，涂布均勻后貼上14種藥敏紙片，用鑷子輕壓紙片使其與培養(yǎng)基表面緊密接觸。放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后測(cè)量抑菌圈直徑。進(jìn)一步通過(guò)PCR方法擴(kuò)增mecA來(lái)確定MRSA陽(yáng)性菌。判斷30 μg頭孢西叮抑菌環(huán)直徑≤21 mm的菌株即為MRSA。

1.5 耐藥基因的檢測(cè)

采用多重PCR的方法對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因(msrA、msrB)、紅霉素類(lèi)耐藥基因(ermA、ermB、ermC)、乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因(vatA、vatB、vatC)、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aacA-D、四環(huán)素類(lèi)耐藥基因(tetk、tetm)、林可胺類(lèi)linA進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 菌株基因組DNA提取

用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落接種至無(wú)菌BHI培養(yǎng)液于37 ℃振蕩過(guò)夜，取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)液于無(wú)菌EP管內(nèi)在12 000 r/min下高速離心，去掉上清液，余下操作步驟按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。DNA提取結(jié)束后，4 μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)上照相。DNA模板于-20 ℃保存，用于MLST分型研究。

1.7 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

MLST分型研究選擇arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi、yqil7個(gè)看家基因，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用相應(yīng)的引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，逐一比對(duì)每個(gè)基因雙向測(cè)序結(jié)果峰圖，確認(rèn)測(cè)序質(zhì)量后將雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，再將待分析測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)并截為標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度，提交數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mlst.net)獲得每株菌株各個(gè)位點(diǎn)的等位基因號(hào)，并由每株細(xì)菌7個(gè)看家基因的等位基因號(hào)再獲得序列號(hào)(sequence typing, STs)。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌分離鑒定結(jié)果

通過(guò)Baird-Parker培養(yǎng)基培養(yǎng)，從221株葡萄球菌中檢出71株SA，在Baird-Parker培養(yǎng)基上長(zhǎng)出灰黑色的菌落見(jiàn)圖1。進(jìn)一步確定通過(guò)16SrRNA引物PCR擴(kuò)增陽(yáng)性見(jiàn)圖2，檢出率為32.1%。

圖1 SA在Baird-Parker培養(yǎng)基的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of SA in Baird-Parker

圖2 16SrRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of 16SrRNA gene by PCRM. Marker 2000； 1-10. Isolates

2.2 MRSA的鑒定及藥敏試驗(yàn)結(jié)果

71株SA中檢出13株MRSA，mecA引物PCR擴(kuò)增陽(yáng)性見(jiàn)圖3，檢出率為18.3%，其中五家渠3株，石河子2株，沙灣4株，瑪納斯4株。13株MRSA對(duì)頭孢西叮的抑菌環(huán)直徑均小于21 mm，耐藥表型不一，所有MRSA均對(duì)青霉素，頭孢西叮和甲氧嘧啶顯示有耐藥表型，此外，有7株表現(xiàn)對(duì)紅霉素有耐藥表型，2株表現(xiàn)對(duì)四環(huán)素有耐藥表型，1株表現(xiàn)對(duì)慶大霉素有耐藥表型?？梢?jiàn)，MRSA主要對(duì)青霉素、頭孢西叮、甲氧嘧啶、紅霉素表現(xiàn)出耐藥見(jiàn)表1。

圖3 mecA基因的PCR擴(kuò)增M. Mark2000； 1-3,6-7,11-13,16-17,20-22:PCR產(chǎn)物Fig.3 Amplification of mecA gene by PCRM. DNA Marker DL-2000;1-3,6-7,11-13,16-17,20-22: PCR products

MRSA菌株MRSAstrains耐藥表型ResistancephenotypeMRSA菌株MRSAstrains耐藥表型ResistancephenotypeSA?xj?06PEN，CFX，TMPSA?xj?27PEN，CFX，TMP，EMSA?xj?08PEN，CFX，TMP，EMSA?xj?41PEN，CFX，TMP，TETSA?xj?10PEN，CFX，TMP，EMSA?xj?42PEN，CFX，TMP，EM，TET，GENSA?xj?13PEN，CFX，TMP，EMSA?xj?43PEN，CFX，TMP，EMSA?xj?14PEN，CFX，TMPSA?xj?59PEN，CFX，TMPSA?xj?21PEN，CFX，TMPSA?xj?61PEN，CFX，TMPSA?xj?22PEN，CFX，TMP

注:PEN.青霉素;CFX.頭孢西叮;TMP.甲氧嘧啶;EM.紅霉素;TET.四環(huán)素;GEN.慶大霉素;

Note: PEN. penicillin;CFX. Cefoxitin;CLI. clindamycin;TMP. Trimethoprim;EM. erythromycin;TET. tetracycline;GEN. gentamicin;

2.3 MRSA耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

13株MRSA均被檢出耐藥基因mecA和linA，其中7株被檢出耐藥基因tetm，4株被檢出耐藥基因AacA-Da，4株被檢出耐藥基因msrB，1株被檢出耐藥基因VatC，與MSSA相比，MRSA的多重耐藥基因的檢出率更高見(jiàn)表2。

表2 13株MRSA攜帶耐藥基因結(jié)果Table 2 The result of carrying resistance genes of 13 strains of MRSA

2.4 MLST 分型結(jié)果

3株MRSA被檢出ST188，ST63， ST9 ，ST2700， ST968 ，ST2373，6種MLST分型，其中2株ST188，檢出率15.38%，3株ST63，檢出率23.08%，3株ST9，檢出率23.08%，2株ST2700，檢出率15.38%，2株ST968，檢出率15.38%，1株ST2373，檢出率7.69%(圖4)。可見(jiàn)不同MRSA分離株的ST型也有所不同。

3 討 論

自從20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)MRSA以來(lái)，金黃色葡萄球菌(SA)的耐藥性呈逐年上升[12]。大量研究已證明，MRSA除了攜帶mecA基因?qū)Ζ?內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥外，同時(shí)還攜帶其他耐藥基因，導(dǎo)致對(duì)其他抗菌藥物的耐藥[13-14]。SA具有多種固有耐藥基因，同時(shí)亦易獲得外來(lái)耐藥基因[15]。有些菌株含有耐藥基因中的1～3種，卻并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)藥物耐藥，說(shuō)明這些菌株雖然攜帶耐藥基因，但是這些耐藥基因并未表達(dá)，其在一定條件下可轉(zhuǎn)化為耐藥菌株，同時(shí)也說(shuō)明此類(lèi)菌株不僅具有潛在的耐藥特性，并且能夠使耐藥基因蔓延擴(kuò)散，因此對(duì)這類(lèi)菌株的耐藥性的防治顯得尤為突出。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，SA耐藥機(jī)制極為復(fù)雜，同一種抗菌藥物的耐藥表型常常源于兩種或兩種以上不同的分子耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果[16]。因此, 針對(duì)耐藥表型所采用的抗菌藥物治療遠(yuǎn)沒(méi)有針對(duì)耐藥基因的抗菌藥物治療有效。因此，從基因水平進(jìn)一步深入探索SA的耐藥機(jī)制具有重要的意義，能夠?yàn)榕R床多重耐藥的 MRSA 感染選擇有效的抗菌藥物。

圖4 13株MRSA的MLST分型結(jié)果Fig.4 The results of MLST genotyping of 13 strains of MRSA

本研究臨床乳房炎MRSA樣品中，檢出了6種耐藥基因(mecA、linA、AacA-Da、tetm、msrB、Vatc)，所有MRSA分離株均檢出mecA和linA耐藥基因，安慧慧等[17]研究中將苯唑西林耐藥表型作為判斷MRSA的依據(jù)。張曉平等[18]研究中將頭孢西叮耐藥表型作為判斷MRSA的依據(jù)。本研究大多數(shù)MRSA菌株檢出多種耐藥基因，與耐藥表型相比，并不是所有對(duì)抗生素有耐藥表型的均能檢出對(duì)應(yīng)的耐藥基因。所檢出的耐藥基因也不一定均有對(duì)應(yīng)的耐藥表型。對(duì)于有耐藥表型能檢測(cè)到相應(yīng)的耐藥基因的存在，表明耐藥表型與耐藥基因的差異性較低，而對(duì)于未能檢測(cè)到相應(yīng)的基因，表明存在耐藥基因的多樣性十分復(fù)雜，可能是由于基因介導(dǎo)的作用較弱，也可能受環(huán)境因素如生長(zhǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間等的影響，從而干擾紙片法檢測(cè)的結(jié)果。

目前，在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中SA可以分成2 840種ST，共收錄了4 929株菌株的相關(guān)信息，而中國(guó)食源性菌株只有91株。經(jīng)eBURST V3分析顯示，中國(guó)食源性菌株ST分布存在5個(gè)克隆群ST97、ST5、ST398、ST1 和 ST9，最大克隆群為ST97，主要起源克隆群為ST398，在本研究檢出的MLST型主要有ST188、ST63、ST9、ST2700、ST968、ST2373，其中ST9和ST63為主要流行株。張怡濱等[19]報(bào)道了兩株從天津某醫(yī)院分離的MRSA，屬于ST9型，這意味著MRSA ST9型與人類(lèi)疾病相關(guān)。Kehrenberg等[20]人已經(jīng)從人、豬及與豬接觸的工作人員中分離出了ST9型的MRSA菌株，說(shuō)明ST9能在人與豬之間傳播。高紅等[21]在寧波市食源性菌株中檢出ST188型。由此可見(jiàn)，本研究中檢出的ST9和ST188等奶牛臨床型乳房炎MRSA分離株與食源性菌株之間存在一定的關(guān)聯(lián)，與人源性菌株之間也有著一定的聯(lián)系，而食源性菌株與人類(lèi)日常生活有著密切的聯(lián)系，因此，奶牛源MRSA在分子水平上存在著向人間傳播擴(kuò)散的潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此開(kāi)展奶牛MRSA流行株耐藥表型、耐藥基因分布及分子分型研究具有重要的意義。

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