蔚 然，王良玉，高 琦，胡文娟，竇海偉，向 莉，辛德莉，郭東星△

(1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院/北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所,北京100050 ；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京100050)

流感嗜血桿菌(Hi)為革蘭陰性菌，是人類呼吸道黏膜的常見定植細菌。流行病學(xué)調(diào)查顯示北京地區(qū)5歲以下急性呼吸道感染患兒2000-2002年呼吸道Hi攜帶率為26.1%，隨著疫苗的應(yīng)用Hi攜帶率有所下降，但2010-2012年仍高達16.3%[1]。Hi是兒童時期細菌性腦膜炎、肺炎和菌血癥的重要病原菌之一，還可導(dǎo)致兒童中耳炎、上頜竇炎、急性會厭炎、化膿性關(guān)節(jié)炎和眼內(nèi)炎等[2]，給兒童健康造成很大威脅。由于Hi毒力較強，病情變化快，其導(dǎo)致的小兒肺炎屬于較嚴重的一種類型，病死率沒有得到有效控制，各地的診治方法也無標準，常有漏診、誤診情況[3]。Hi的早期、快速、準確檢測，對疾病的早期治療、疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后起到非常重要的作用?，F(xiàn)有診斷方法，如分離培養(yǎng)、血清學(xué)診斷等不能滿足臨床需要，需不斷探索早期、快速診斷Hi感染的新方法。近年來，分子生物學(xué)診斷正逐漸成為研究的熱點。本研究擬建立一種SYBR-Green染料法實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測Hi感染的方法，以期實現(xiàn)Hi的臨床早期、快速、準確診斷。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采集2014年9-12月就診于北京兒童醫(yī)院的患兒咽拭子標本226份。本研究通過倫理審查，患兒家屬均知情同意。菌株：肺炎支原體標準株M129菌株(ATCC29342)、人型支原體標準株(ATCC15488)、陰溝腸桿菌標準株(ATCC700323)、金黃色葡萄球菌標準株(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌標準株(ATCC1705)和大腸埃希菌標準株(ATCC25922)，含有Hi fucK基因質(zhì)粒的大腸埃希菌凍存于本研究室。

1.2儀器與試劑 ABI公司Prism@7500型熒光定量PCR儀；高純度質(zhì)粒小提試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，貨號CW0500S，生產(chǎn)批號20121)；通用型柱式基因組提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2298S，生產(chǎn)批號40137)；PCR熒光染料為ULtra SYBR Mixture(康為世紀生物科技有限公司，貨號CW2601M，生產(chǎn)批號10209)。

1.3方法

1.3.1構(gòu)建標準品 復(fù)蘇凍存于-80 ℃冰箱的含有Hi fucK基因的大腸埃希菌，構(gòu)建質(zhì)粒，采用康為世紀高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，實驗操作參考產(chǎn)品說明書。對提取的質(zhì)粒進行定量分析，10倍稀釋構(gòu)建水平為108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質(zhì)粒作為標準品，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2設(shè)計并合成引物 針對Hi的fucK基因設(shè)計引物Hi-F/Hi-R，引物序列Hi-F：ATGGCGGGAACATCAATGA；Hi-R：ACGCATAGGAGGGAAATGGTT。引物由美國Invitrogen公司合成，經(jīng)HPLC方式純化。

1.3.3繪制標準曲線 以標準品為模板進行染料法熒光定量PCR，繪制標準曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×Taqman緩沖液10 μL，引物Hi-F/Hi-R各0.3 μL， DNA 模板2.0 μL，ddH2O 8.0 μL，總體積20.0 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用ABI公司7500型熒光定量PCR儀的SDS軟件分析實驗結(jié)果并繪制標準曲線。

1.3.4方法學(xué)驗證 (1)敏感度：將構(gòu)建的標準品稀釋為107、106、105、104、103、102、10 copy/μL，采用和繪制標準曲線時相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，檢測新建的實時熒光定量PCR的敏感度。(2)特異度：以本實驗室保存的肺炎支原體、人型支原體、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的DNA作為檢測模板，驗證新建的實時熒光定量PCR特異度。(3)檢驗臨床標本：采集的226份兒科患兒的咽拭子標本，均采用通用型柱式基因組提取試劑盒提取DNA，實驗操作參考產(chǎn)品說明書。用新建的實時熒光定量PCR檢測Hi的感染情況，反應(yīng)體系和條件均參照構(gòu)建標準曲線時采用的體系和條件。根據(jù)標本擴增的Ct值≤38、Tm值與標準品相符，且結(jié)合擴增曲線、溶解曲線，判定為陰陽性。

2 結(jié) 果

2.1標準曲線 10倍梯度稀釋用標準株提取的質(zhì)粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質(zhì)粒標準品，用Hi-F/Hi-R引物分別擴增標準品，以標準品水平為橫坐標，對應(yīng)的Ct值為縱坐標，采用SDS軟件分析實驗結(jié)果并繪制標準曲線。標準曲線方程：Y=-3.335 976X+35.492 149(R2=0.999)；模板量與Ct值具有良好的相關(guān)性，能夠?qū)δ０宥俊Ｒ妶D1。

圖1 標準曲線

2.2敏感度 10倍梯度稀釋用標準株提取的質(zhì)粒，108、107、106、105、104、103、102、10 copy/μL的質(zhì)粒標準品，用Hi-F/Hi-R引物分別擴增標準品，檢驗新建熒光定量PCR的敏感度。新建實時熒光定量PCR可檢測拷貝數(shù)為10 copy的基因模板。見圖2。

注：108、107、106、105、104、103、102、10分別代表標準品模板拷貝量

圖2標準品擴增曲線

2.3特異度 大腸埃希菌、陰溝腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎克雷伯菌和人型支原體標準株的DNA作為檢測模板，驗證新建實驗室診斷方法的特異度。結(jié)果顯示以上幾種病原體DNA均為陰性，新建實驗室診斷方法具有良好的特異度。見圖3。

注：A為Hi標準品；B為陰溝腸桿菌標準株；C為大腸埃希菌標準株；D為肺炎支原體標準品；E為金黃色葡萄球菌標準品；F為人型支原體標準品；G為肺炎克雷伯菌標準株

圖3 Hi的標準品與其他菌株標準株的溶解曲線

2.4臨床標本檢測 用新建實時熒光定量PCR檢測臨床標本提取的DNA，結(jié)果顯示，226份咽拭子標本Ct值≤38，Tm值與標準品相符；結(jié)合擴增曲線、溶解曲線，判定為陽性，陽性檢出率為40.70%。PCR陽性產(chǎn)物測序(由生工生物工程股份有限公司完成)并與美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)已發(fā)布的Hi菌株的基因序列比對，陽性率為92.3%。見圖4。

注：A為溶解曲線；B為擴增曲線

圖4臨床標本、Hi標準品的溶解曲線與擴增曲線

3 討 論

有研究報道，綜合192個國家的流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺炎仍是導(dǎo)致兒童死亡的首要病因，其中由Hi引起的死亡占16.0%，我國由Hi感染引起的死亡占21.2%，高于世界平均水平[4-5]?？赡苡捎贖i感染的臨床表現(xiàn)及胸部X線征象缺乏特異性，診斷Hi感染往往需要結(jié)合實驗室診斷方法[6]。對Hi感染的早期、快速、準確診斷對指導(dǎo)臨床合理規(guī)范用藥至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)被認為是診斷Hi感染的金標準，但培養(yǎng)所需時間較長(36～72 h)，難以實現(xiàn)快速鑒定[7]，對臨床早期診斷的意義不大。該方法受培養(yǎng)條件、標本保存與運輸、實驗室培養(yǎng)條件等諸多因素影響。有報道稱，經(jīng)改良培養(yǎng)基后，Hi分離率有所提高，也僅為59.9%[8-9]。血清學(xué)診斷方法主要通過檢測血清中的特異性抗原、抗體滴度的變化等判斷病原體感染，有研究報道其敏感度高于分離培養(yǎng)[10]。但血清抗體產(chǎn)生需4～5 d,不能進行快速檢測，且容易產(chǎn)生假陰性。因此，血清學(xué)診斷方法常用于回顧性診斷，不建議作為確診依據(jù)[11-12]。

分子生物學(xué)診斷技術(shù)自1990年首次用于Hi的鑒定后，因其快速、敏感、特異、簡單等優(yōu)點，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前已報道的分子生物學(xué)診斷Hi感染的方法有傳統(tǒng)PCR、巢式PCR、多重PCR、高分辨率溶解曲線等[13]。NAKHJAVANI等[14]將PCR用于Hi的檢測，并與常規(guī)培養(yǎng)法和血清學(xué)方法比較,PCR使檢出率明顯提高。理論上認為實時定量PCR較傳統(tǒng)PCR更敏感，并可實時監(jiān)測，實驗過程中即可判斷結(jié)果。實時定量PCR較巢式PCR，可以減少核酸污染問題，操作更簡便。實時定量PCR相較于多重PCR，用時更短，實驗條件更易優(yōu)化，敏感度更高。有研究顯示，以實時定量PCR為參考標準，多重PCR的敏感度、特異度分別僅為30.0%、75.0%[15]。

COUGHLAN等[16]研究證實，fucK基因是目前發(fā)現(xiàn)的Hi特異度、敏感度最高，應(yīng)用最廣的基因。本研究針對Hi的fucK基因設(shè)計引物，保障引物設(shè)計的合理性、可行性。相對于探針法，染料法不需要設(shè)計特異性探針，成本更低，更簡單。熒光定量PCR相對于常規(guī)分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷更加快速、簡易。本方法可檢測Hi基因拷貝數(shù)為10 copy的樣品，相較于商品試劑盒[17]，其具有較高的敏感度，且成本較低。采用幾種不同常見細菌DNA標本，驗證其特異度，本實驗中幾種病原不存在交叉反應(yīng)，具有良好的特異度。但所選用的特異性實驗菌種較為有限，在后續(xù)研究中，還應(yīng)選擇更多的菌種進行實驗，對其特異度進一步的驗證。完善和優(yōu)化實驗條件后，226份臨床標本檢出Hi陽性92份，陽性率為40.70%。其PCR陽性產(chǎn)物測序與NCBI已發(fā)布的HI菌株的基因序列比對，準確率為92.3%。

綜上所述，本研究中建立的實時定量PCR檢測Hi的實驗室診斷方法具有早期、快速、簡便、靈敏的優(yōu)勢，是Hi感染臨床診斷、流行病學(xué)調(diào)查、混合感染判定的可行手段，具有較高的推廣應(yīng)用價值。

[1]王愛華．流感嗜血桿菌感染與耐藥[J]．中華實用兒科臨床雜志，2016，31(4)：256-258．

[2]胡俊，王曉蕾，許峰，等．流感嗜血桿菌陽性住院患兒回顧性流行病學(xué)調(diào)查[J]．中國當代兒科雜志，2015，17(6)：596-601．

[3]孟亞輝．42例確診小兒社區(qū)獲得性流感嗜血桿菌肺炎病臨床分析[J]．中國農(nóng)村衛(wèi)生，2015,8(12)：16-17．

[4]RUDAN I,O'BRIEN K L,NAIR H,et al.Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010:estimates of incidence,severe morbidity,mortality,underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries[J].J Glob Health,2013,3(1):010401.

[5]FANG W,RAN L,YING S,et al.A pilot study of quantitative loop-mediated isothermal amplification-guided target therapies for hospital-acquired pneumonia[J].Chin Med J,2016,129(2):181-186.

[6] 王宏.流感嗜血桿菌肺炎的診斷[J].中外健康文摘,2011,8(25):174-175.

[7]陸偉桃，郭菁，鄧晨暉，等．探討全自動快速微生物檢測系統(tǒng)在鑒定流感嗜血桿菌的應(yīng)用[J]．檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2016，13(7)：944-945．

[8]楊帥．b型流感嗜血桿菌感染疾病流行病學(xué)及防治研究進展[J]．中國病毒病雜志，2009,11(6)：465-468．

[9]張建明，滕昆侖，盧勉飛，等．不同動物血液對流感嗜血桿菌生長影響的研究[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2016,26(17)：2487-2489．

[10]王明清,管嬌瓊,龍藝,等.b型流感嗜血桿菌多糖間接競爭ELISA檢測方法的建立[J].中國生物制品學(xué)雜志,2015,28(6):623-627.

[11]張莉滟，陳林，吳忠道．流感嗜血桿菌16S rRNA和p6基因PCR檢測結(jié)果比較[J]．重慶醫(yī)學(xué)，2009，38(23)：2960-2962．

[12]周凱，李立群，徐飛，等．小兒下呼吸道流感嗜血桿菌感染的血清分型及耐藥分析[J]．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，43(4)：643-645．

[13]PICKERING J,BINKS M J,BEISSBARTH J A,et al.A PCR-High-Resolution melt assay for rapid differentiation of nontypeable haemophilus influenzae and haemophilus haemolyticus[J].J Clin Microbiol,2014,52(2):663-667.

[14]NAKHJAVANI F A,HASHEMI F B,KALANI M T,et al.Detection of haemophilus influenzae type b in cerebrospinal fluid of suspected children with meningitis by pcr[J].Med J Islamic Repub Iran,2005,19(2):181-184.

[15]丁振堯，李紅微，郭美麗，等．多重PCR檢測浙江沿海地區(qū)兒童肺炎細菌性病原研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2014，26(1)：46-50．

[16]COUGHLAN H,REDDINGTON K,TUITE N,et al.Comparative genome analysis identifies novel nucleic acid diagnostic targets for use in the specific detection of Haemophilus influenzae[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2015,83(2):112-116.

[17]DE FILIPPIS I,DE ANDRADE C F,CALDEIRA N,et al.Comparison of PCR-based methods for the simultaneous detection of Neisseria meningitidis,Haemophilus influenzae,and Streptococcus pneumoniae in clinical samples[J].Braz J Infect Dis,2016,20(4):335-341.