伍荷潔，張麗萍，舒青龍

(江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南昌330004)

人類胃腸道棲息著1 000～1 150種細(xì)菌[1]。中藥復(fù)方通過對腸道菌群進行調(diào)節(jié)，加強益氣健脾之力，恢復(fù)宿主的微生態(tài)平衡從而治療腸道菌群失衡導(dǎo)致的各類疾病，效果良好[2]。中藥復(fù)方成分復(fù)雜，何種成分及其作用于腸道菌群的藥理機制尚不明確。植物類中藥中，多糖是一類重要的有效成分。文獻(xiàn)已報道中藥多糖具有多種生物活性[3]。中藥提取物中含有的多糖類物質(zhì)如N-乙酰葡萄糖胺多聚物對腸道菌群有促進作用[4]。但在人類飲食中，許多復(fù)雜的植物多糖由于不溶性或人類編碼水解酶缺乏導(dǎo)致抗降解[5～7]。擬桿菌和厚壁菌是腸道豐度最大且在腸道微生態(tài)響應(yīng)中最為重要的菌群之一，為中藥基于微生態(tài)起效應(yīng)的主要靶點，尤其是擬桿菌。而且，擬桿菌在多糖底物利用中的作用也尤為突出[8]。本研究選用治療脾胃虛寒的經(jīng)典基礎(chǔ)方理中湯及降解多糖最有特色的兩株擬桿菌(多形擬桿菌、脆弱擬桿菌)進行實驗；同時，為體現(xiàn)擬桿菌和厚壁菌利用碳源的差異性，我們還選用了兩株臨床分離的厚壁菌進行培養(yǎng)。本研究觀察了不同濃度理中湯多糖作為碳源對腸道擬桿菌及厚壁菌體外生長的影響，進一步探討理中湯調(diào)節(jié)腸道菌群的作用機制，為理中湯的臨床應(yīng)用提供微生態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、菌株與主要實驗材料藥物 理中湯(黨參6 g、干姜9 g、炙甘草6 g、白術(shù)12 g)購于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。菌株：多形擬桿菌(ATCC29148)、脆弱擬桿菌(ATCC25285)、梭菌(C6)、艱難梭菌(SH186)；所收集的菌液進行DNA提取，擴增16S rRNA并到NCBI數(shù)據(jù)庫上進行比對，確定為目的菌株。腦心浸液肉湯(BHI)固體培養(yǎng)基、BHI液體培養(yǎng)基(Oxoid公司)，NaCl、(NH4)2SO4、L-半胱氨酸、瓊脂(上海生物工程有限公司)，La Taq酶(Takara公司)，EB替代染料(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。厭氧工作站(MarkⅡ，荷蘭Mark公司)，顯微鏡(Leica DM2500，德國徠卡儀器有限公司)，超凈工作臺(SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，紫外可見分光光度計(UV-2012C，蘇州江東精密儀器有限公司)，生化培養(yǎng)箱(SPX-150B-Z，上海光都儀器設(shè)備有限公司)，臺式高速離心機(H1650，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)，pH計(pH400，上海安萊立思儀器科技有限公司)。

1.2 理中湯多糖的提取 采用水提醇沉法提取理中湯總多糖，用sevag試劑去除粗多糖中的蛋白質(zhì)，然后用大孔陰離子交換樹脂去除色素得到后續(xù)實驗中需要的理中湯多糖(多糖含量94.2%，蛋白含量0.65%)。

1.3 菌株分組及理中湯多糖的用法 將兩株典型腸道擬桿菌(多形擬桿菌和脆弱擬桿菌)及兩株厚壁菌(梭菌和艱難梭菌)分別分為多糖組、葡萄糖組、BHI組培養(yǎng)。多糖組中多形擬桿菌分別以含1%、5%、10%、20%、30%、40%的理中湯多糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，脆弱擬桿菌分別以含1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%的理中湯多糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；葡萄糖組以含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)；BHI組以含BHI的培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組做3個生物學(xué)重復(fù)。將各組搖瓶放入?yún)捬豕拗?，充入無氧混合氣(80%N2、10%H2、10%CO2)，厭氧罐放入恒溫箱37℃培養(yǎng)。

1.4 細(xì)菌生長觀察 擬桿菌分別于培養(yǎng)8、14、20、26、32、38、44、50、56 h，厚壁菌分別于培養(yǎng)8、14、20、26、32、38 h取各組菌液1 mL，于12000 r/min離心3 min，去上清，用雙蒸水重懸，再用分光光度計在波長為600 nm處測定OD值。

1.5 細(xì)菌含量測定 將細(xì)菌放在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期后取菌懸液1 mL并測定其OD值，將其等梯度稀釋10-7～10-9后，取稀釋后各梯度的菌懸液0.1 mL涂布至BHI固體培養(yǎng)基，每梯度做3個生物學(xué)重復(fù)，厭氧處理后置于恒溫箱37 ℃培養(yǎng)，對生成的菌落進行計數(shù)，取其平均值，根據(jù)公式：細(xì)菌數(shù)量=菌落計數(shù)平均值×稀釋倍數(shù)，換算成不同OD值所對應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 各組多形擬桿菌濃度比較 ①不同濃度的理中湯多糖培養(yǎng)下的比較。按多形擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較：40%、30%、20%、10%、5%、1%濃度理中湯多糖組的多形擬桿菌分別在培養(yǎng)44、44、32、38、44、44 h時濃度達(dá)峰值。按多形擬桿菌體外生長最大值進行排序依次為：30%、40%、20%、10%、5%、1%理中湯多糖組。②理中湯多糖和BHI碳源培養(yǎng)下的比較。按多形擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較：BHI組的多形擬桿菌在培養(yǎng)26 h時濃度達(dá)峰值，較理中湯多糖組達(dá)峰值的時間更短；按多形擬桿菌體外生長最大值比較：20%和30%濃度多糖組細(xì)菌生長至32h后濃度均高于BHI組。③理中湯多糖和葡萄糖碳源培養(yǎng)下的比較。按多形擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較：葡萄糖組的多形擬桿菌在培養(yǎng)56 h時濃度達(dá)峰值，較所有理中湯多糖組達(dá)峰值的時間更長；按多形擬桿菌體外生長最大值比較：5%及以上濃度的多糖組細(xì)菌生長至14 h后濃度均高于葡萄糖組。④BHI碳源和葡萄碳源培養(yǎng)下的比較：按多形擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較。BHI組的多形擬桿菌較葡萄糖組達(dá)峰值的時間更短；按多形擬桿菌體外生長最大值比較：不同培養(yǎng)時間BHI組多形擬桿菌濃度均高于葡萄糖組。以上結(jié)果表明：三種不同碳源(理中湯多糖、BHI碳源、葡萄糖)培養(yǎng)基對于多形擬桿菌體外生長的影響存在明顯的差異，從多形擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間上看，BHI組為最短，與BHI作為厭氧細(xì)菌實驗最常用的碳源的情況相符；但從按多形擬桿菌體外生長最大值上看，20%和30%濃度理中湯多糖組則高于BHI組；5%及以上濃度的多糖組細(xì)菌生長至14 h后濃度均高于葡萄糖組；同時，不同濃度的理中湯多糖的實驗表示：當(dāng)多糖濃度為1%至20%時，多形擬桿菌的生長隨多糖濃度上升而增加，但高濃度多糖中30%濃度組稍優(yōu)于40%濃度組。以上提示：理中湯多糖是一種適合多形擬桿菌生長的優(yōu)勢碳源，對于多形擬桿菌體外生長的最優(yōu)濃度為30%(P均<0.05)。

2.2 各組脆弱擬桿菌濃度比較 ①不同濃度的理中湯多糖培養(yǎng)下的比較。按脆弱擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較：60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%濃度理中湯多糖組的脆弱擬桿菌分別在培養(yǎng)38、38、56、26、26、56、44、44 h時濃度達(dá)峰值。按脆弱擬桿菌體外生長最大值進行排序依次為：50%、30%、40%、20%、60%、10%、5%、1%理中湯多糖組。②理中湯多糖和BHI碳源培養(yǎng)下的比較。按脆弱擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較：BHI組的脆弱擬桿菌在培養(yǎng)20h時濃度達(dá)峰值，較理中湯多糖組達(dá)峰值的時間更短；按多形擬桿菌體外生長最大值比較：30%和50%濃度多糖組細(xì)菌生長至26 h后濃度高于BHI組，40%濃度多糖組細(xì)菌生長至38 h后濃度高于BHI組。③理中湯多糖和葡萄糖碳源培養(yǎng)下的比較。按脆弱擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較：葡萄糖組的多形擬桿菌在培養(yǎng)56 h時濃度達(dá)峰值；較10%和40%的理中湯多糖組達(dá)峰值的時間更短，較20%、30%、50%、60%理中湯多糖組達(dá)峰值的時間更長；按脆弱擬桿菌體外生長最大值比較：不同培養(yǎng)時間20%、30%、40%、50%多糖組脆弱擬桿菌濃度均高于葡萄糖組。④BHI碳源和葡萄碳源培養(yǎng)下的比較。按脆弱擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間比較：BHI組的脆弱擬桿菌較葡萄糖組達(dá)峰值的時間更短；按脆弱擬桿菌體外生長最大值比較：不同培養(yǎng)時間BHI組脆弱擬桿菌濃度均高于葡萄糖組。以上結(jié)果表明：三種不同碳源(理中湯多糖、BHI碳源、葡萄糖)培養(yǎng)基對于脆弱擬桿菌體外生長的影響存在明顯的差異，從脆弱擬桿菌體外生長達(dá)到峰值的生長時間上看，BHI組為最短，與BHI作為厭氧細(xì)菌實驗最常用的碳源的情況相符；但從按脆弱擬桿菌體外生長最大值上看，30%和50%濃度多糖組細(xì)菌生長至26 h后濃度高于BHI組，40%濃度多糖組細(xì)菌生長至38 h后濃度高于BHI組。不同培養(yǎng)時間20%、30%、40%、50%多糖組脆弱擬桿菌濃度均高于葡萄糖組；同時，不同濃度的理中湯多糖的實驗表示：當(dāng)多糖濃度為1%至10%時，脆弱擬桿菌的生長隨多糖濃度上升而增加，但高濃度多糖中脆弱擬桿菌的生長并不隨多糖濃度的增加呈正態(tài)分布。以上提示：理中湯多糖是一種適合擬桿菌生長的優(yōu)勢碳源，對于脆弱擬桿菌體外生長的最優(yōu)濃度為50%(P均<0.05)。

2.3 各組梭菌濃度比較 各組梭菌均于培養(yǎng)8h開始生長。BHI組的梭菌在培養(yǎng)20 h濃度達(dá)峰值；葡萄糖組的梭菌在培養(yǎng)38h濃度達(dá)峰值；40%、30%、20%、10%、5%、1%濃度多糖組的梭菌分別在培養(yǎng)38、38、32、20、32、38 h濃度達(dá)峰值。不同培養(yǎng)時間BHI組梭菌濃度均高于葡萄糖組和多糖組(P均<0.05)。

2.4 各組艱難梭菌濃度比較 BHI組的艱難梭菌在培養(yǎng)16 h濃度達(dá)峰值，為(20.010±1.016)×1010CFU/mL，葡萄糖組和多糖組的艱難梭菌未見生長。

3 討論

中醫(yī)傳承的整體觀念與微生態(tài)平衡理論不謀而合。腸道菌群對維持機體健康至關(guān)重要，與多種疾病密切相關(guān)。何種成分在中藥微生態(tài)機制中起主要作用，這是中醫(yī)藥微生態(tài)研究的重要課題之一。多糖作為中藥中重要的有效成分，其藥理作用不斷被發(fā)掘。研究[9]證明黃芪、白術(shù)、防風(fēng)按一定比例提取的復(fù)合多糖能提高免疫功能低下小鼠的脾指數(shù)。但以多糖為靶點研究中藥復(fù)方對腸道菌群的作用機制并不多見，是中醫(yī)藥微生態(tài)研究的一個新方向。

理中湯運用于各科疾病的治療療效顯著，相關(guān)基礎(chǔ)研究也取得了很大進展。成云水等[10]發(fā)現(xiàn)理中湯治療小兒高熱效果明顯。王曉英等[11]證明加味附子理中湯配合針灸治療早搏療效顯著。王宇飛等[12]證明加味理中湯聯(lián)合穴位注射治療反流性食管炎療效較好。同時，理中湯對慢性結(jié)腸炎和功能性消化不良也有較好療效[13,14]。也有研究[15]發(fā)現(xiàn)理中湯可調(diào)節(jié)D-IBS大鼠胃腸轉(zhuǎn)運功能和血清及小腸的SP、CCK水平，影響抗生素相關(guān)性腹瀉模型中的腸道菌群分布等。然而目前從碳源角度解釋理中湯調(diào)節(jié)腸道菌群機制的研究仍舊缺失。

鑒于不同菌群利用多糖能力的差異，在菌種選擇上，本研究選用的是在正常人體腸道中分布超過90%的細(xì)菌：擬桿菌和厚壁菌。尤其是擬桿菌，對環(huán)境應(yīng)變能力敏感，其基因組編碼大量糖基水解酶、糖代謝過程相關(guān)酶，可幫助宿主有效利用多糖[16]。因此，我們選用了降解多糖最有特色的兩株擬桿菌，即多形擬桿菌和脆弱擬桿菌。同時，為體現(xiàn)不同菌株利用碳源的差異性，我們還選用了兩株厚壁菌進行培養(yǎng)。我們提取了高濃度、低蛋白的理中湯多糖，以不同濃度的理中湯多糖加入到基本培養(yǎng)基中作為惟一碳源，厭氧處理后對兩株擬桿菌及兩株厚壁菌進行恒溫培養(yǎng)，觀察理中湯多糖對擬桿菌和厚壁菌體外生長的影響。

本研究結(jié)果顯示，對于兩株擬桿菌，多糖組細(xì)菌濃度高于BHI組，BHI組高于葡萄糖組，其中30%濃度多糖組的多形擬桿菌濃度最高，50%濃度多糖組的脆弱擬桿菌濃度最高。這表明理中湯可以基于多糖成份影響擬桿菌的體外生長，且影響程度和多糖含量有關(guān)，細(xì)菌濃度并不隨著多糖濃度增加而增加；而且，一定濃度的理中湯多糖較其他碳源更能影響擬桿菌體外生長。對兩組厚壁菌生長情況進行觀察發(fā)現(xiàn)，BHI組的梭菌濃度高于多糖組和葡萄糖組；僅BHI組的艱難梭菌有生長，而葡萄糖組和多糖組的艱難梭菌未見生長。上述結(jié)果提示不同濃度的理中湯多糖均能影響典型擬桿菌的體外生長，相對于BHI和葡萄糖碳源的影響，理中湯多糖是一種適合擬桿菌生長的優(yōu)勢碳源，對于多形擬桿菌和脆弱擬桿菌體外生長的最優(yōu)濃度分別為30%和50%；但理中湯多糖對厚壁菌的生長促進作用不明顯，甚至有抑制作用。我們認(rèn)為，中藥復(fù)方理中湯多糖作為碳源可促進典型腸道擬桿菌的增長，這種碳源機制使得腸道擬桿菌在理中湯多糖成分的影響下具有競爭優(yōu)勢，從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。同時，本實驗中不同濃度理中湯多糖對擬桿菌生長影響的差異性可為臨床用藥劑量和用藥周期提供參考。