閆磊，黃天明，羅國(guó)容

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157011；2廣西醫(yī)科大學(xué))

研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)動(dòng)力素蛋白(kinectin)可能存在8個(gè)選擇拼接區(qū)(V1～V8)，其中V4選擇拼接區(qū)所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為3 278～3 364 bp，其拼接方式的不同可產(chǎn)生多種功能不同的kinectin異構(gòu)體。2015年1月～2016年12月，我們采用RT-PCR法檢測(cè)kinectin基因V4L異構(gòu)體在人肝癌組織與癌旁組織、正常肝組織中表達(dá)的差異性，為探索V4L異構(gòu)體與肝癌發(fā)生、kinectin抗體的產(chǎn)生是否存在關(guān)聯(lián)提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)許可，于醫(yī)院肝膽外科收集45例肝癌患者的癌組織標(biāo)本、配對(duì)癌旁組織及血清標(biāo)本，10例正常肝組織標(biāo)本取自肝囊腫、肝外傷患者。肝癌患者中男39例、女6例，年齡32～75歲，術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療。胎牛血清、胰蛋白酶、TRIzol Reagent(美國(guó)Gibco公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、D-Hank′s液(美國(guó)Hyclone公司)；系統(tǒng)多通道PCR儀(MJPT-220)、Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 kinectin基因V4L異構(gòu)體檢測(cè)方法 采用RT-PCR法。根據(jù)GenBank人類(lèi)kinectin全長(zhǎng)序列中V4選擇拼接區(qū)的序列，應(yīng)用Primer5設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物跨越V4區(qū)，可得到2個(gè)目的片段：V4L(包含V4選擇拼接區(qū)的長(zhǎng)kinectin 異構(gòu)體)、V4S(不包含V4選擇拼接區(qū)的短kinectin 異構(gòu)體)。引物由上海捷瑞基康生物技術(shù)有限公司合成，V4上游引物5′-TTAGATTCTTTGAAGGATGCAGTTGA-3′、下游引物5′-AGATCGTTCCATCTCTGCCTTTTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度621 bp(V4L)、534 bp(V4S)；內(nèi)參照β-actin上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度225 bp。采用TRIzol試劑一步法提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL): 去離子水9.5 μL，10×Master Mix 12.5 μL，上下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，模板cDNA 2.0 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后用Bio-Rad 凝膠成像儀成像，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。用美國(guó)Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，以Quantity One軟件計(jì)算V4L/β-actin、V4S/β-actin，從而得出2種目的基因的相對(duì)含量，以V4L/V4S表示kinectin基因V4L異構(gòu)體的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 肝癌患者血清kinectin抗體檢測(cè)方法 采用ELSIA法。用包被緩沖液將MBP-kinectin稀釋至5.0 μg/mL，取100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4 ℃濕盒過(guò)夜。5%脫脂奶(300 μL/孔)37 ℃封閉1 h后，陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照加入待檢稀釋血清(1∶16)各100 μL/孔，37 ℃濕盒孵育2 h。加入Biotin-綿羊抗人IgG單克隆抗體(1∶5 000)，37 ℃濕盒溫育2 h，1×PBS-T洗板5次。加入streptavidin-HRP(1∶4 000)，37 ℃濕盒溫育1 h，1×PBS-T洗板4次。TMB避光顯色20 min，加1 mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處讀取OD值?？瞻讓?duì)照用PBS代替血清，其余步驟同上。血清kinectin抗體水平以滴度表示。

2 結(jié)果

2.1 不同肝組織中kinectin基因V4L異構(gòu)體表達(dá)情況比較 肝癌組織中kinectin基因V4L/V4S為2.709±1.025，癌旁組織中為1.564±0.357，正常肝組織為1.507±0.499；經(jīng)兩兩比較，肝癌組織中V4L/V4S高于癌旁組織和正常肝組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.698，P=0.000)。

2.2 肝癌患者血清kinectin抗體與肝癌組織中kinectin基因V4L異構(gòu)體表達(dá)的關(guān)系 肝癌患者血清kinectin抗體滴度值為0.170 7±0.023 1，與肝癌組織中kinectin基因V4L/V4S不相關(guān)(r=-0.410，P>0.05)。

3 討論

kinectin是一種與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜受體蛋白，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。人的kinectin基因由46個(gè)外顯子共4 816個(gè)核苷酸組成，開(kāi)放閱讀框位于188～4 258核苷酸處[1]。kinectin基因上可能存在多個(gè)選擇拼接區(qū)，可通過(guò)構(gòu)成多種不同的選擇拼接異構(gòu)體蛋白而行使不同的功能[2]。選擇性拼接是一種常見(jiàn)的真核生物hnRNA轉(zhuǎn)錄后加工的方法[3,4]。很多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中某些基因選擇性拼接發(fā)生異常改變，導(dǎo)致該基因選擇性拼接異構(gòu)體出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)或表達(dá)降低促使腫瘤發(fā)生[5,6]。V4選擇拼接區(qū)包含87個(gè)堿基對(duì)，其缺失將導(dǎo)致29個(gè)氨基酸的缺失，V4選擇拼接區(qū)拼接方式的不同可能產(chǎn)生不同的kinectin異構(gòu)體。不同的kinectin異構(gòu)體有不同的功能，其比例平衡維持著kinectin的正常生理功能；而異構(gòu)體之間的比例失調(diào)，將可能導(dǎo)致kinectin的正常生理功能發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞病變[7～12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中kinectin基因V4L異構(gòu)體表達(dá)高于癌旁組織和正常肝組織，這表明V4L異構(gòu)體在肝癌組織中過(guò)度表達(dá)，可能與肝癌發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。在正常肝組織中kinectin占優(yōu)勢(shì)地位的異型體為V4S，即V4選擇拼接區(qū)被剪接掉的kinectin異構(gòu)體；而當(dāng)kinectin基因選擇性拼接的調(diào)控機(jī)制發(fā)生異常時(shí)，可能使V4選擇拼接區(qū)的選擇性拼接發(fā)生相應(yīng)的改變，導(dǎo)致V4L異構(gòu)體過(guò)量表達(dá)，使kinectin異構(gòu)體之間的比例發(fā)生改變，進(jìn)而影響了kinectin的正常生理功能從而導(dǎo)致細(xì)胞病變。有學(xué)者[5]推斷，肝癌患者血清中kinectin抗體產(chǎn)生的機(jī)制，可能與V4L異構(gòu)體過(guò)度增殖并且發(fā)生抗原性改變而被免疫系統(tǒng)識(shí)別有關(guān)。本研究對(duì)肝癌組織kinectin基因V4L/V4S與血清中kinectin抗體滴度值進(jìn)行比較，尚未發(fā)現(xiàn)兩者之間具有相關(guān)性，未證實(shí)該學(xué)者的觀點(diǎn)。可能原因如下：①個(gè)別肝癌患者可能會(huì)出現(xiàn)免疫耐受[13～15]，免疫活性細(xì)胞接觸V4L異構(gòu)體后表現(xiàn)出特異性的無(wú)應(yīng)答狀態(tài)，不產(chǎn)生抗體；②抗體產(chǎn)生的階段性；③本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量只有45例，在相關(guān)分析時(shí)，樣本量過(guò)少。kinectin抗體的產(chǎn)生機(jī)制還比較復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究，今后將增大樣本量繼續(xù)進(jìn)行探索。

目前，關(guān)于kinectin選擇拼接區(qū)的研究在國(guó)內(nèi)外還很少，處于剛剛起步階段。隨著研究的不斷深入，將可能闡明kinectin作為肝癌相關(guān)抗原的機(jī)制，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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[1] Fütterer A, Kruppa G, Krmer B, et al. Molecular cloning and characterization of human kinectin[J]. Mol Bio Cell,1995,6(2):161-170.

[2] Santama N, Er CP, Ong LL, et al. Distribution and functions of kinectin isoforms[J]. J Cell Sci, 2004,117(Pt 19):4537-4549.

[3] 徐谷峰,周承亮,黃荷鳳,等.選擇性剪接調(diào)控的研究進(jìn)展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,35(5):769-771.

[4] 徐敏杰,竇同海,徐佳熹,等.癌癥相關(guān)基因選擇性剪接進(jìn)化數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,55(5):649-659.

[5] Xin Y, Grace A, Gallagher MM, et al. CD44V6 in gastric carcinoma: a marker of tumor progression [J]. App Immunohistochem Mol Morphol Aimm, 2001,9(2):138-142.

[6] Wang L, Duke L, Zhang PS, et al. Alternative splicing disrupts a nuclear localization signal in spleen tyrosine kinase that is required for invasion suppression in breast cancer [J]. Cancer Res, 2003,63(15):4724-4730.

[7] 侯朋飛,金宏麗,李嶺,等.鼠源Bif-1蛋白7種選擇性剪接異構(gòu)體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2016,32(1):906-911.

[8] 邢永強(qiáng),劉國(guó)慶,蔡祿,等.Pre-mRNA選擇性剪接的調(diào)控及選擇性剪接數(shù)據(jù)庫(kù)[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2017,30(9):906-911.

[9] 王文君,史志周.環(huán)狀RNA在腫瘤癌變中的作用機(jī)制和臨床意義[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2017,37(1):229-230.

[10] 陳力,李金平,晁耐霞,等.GCF2選擇性剪接區(qū)在肝癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)及意義[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014,31(3):355-357.

[11] 陳偉霞,陳彬,徐燕,等.選擇性剪接調(diào)控蛋白PTB及同源蛋白的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2017,17(33):6561-6535.

[12] 楊志崗,馬世澤,傅歆,等.CD49f剪接異構(gòu)體在不同細(xì)胞系中的表達(dá)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2017,37(11):1562-1567.

[13] 林川川,宋志強(qiáng),羅娜.新式免疫佐劑在過(guò)敏原特異性免疫耐受治療中的研究進(jìn)展[J]. 免疫學(xué)雜志,2017,33(11):1003-1008.

[14] 辛勝,楊麗莎,譚占超,等.HBV感染不同免疫狀態(tài)與PCⅢ、C-Ⅳ表達(dá)水平的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥,2012,52(13):10-12.

[15] 高紅艷,劉娜,李春霞,等.慢性HBV感染者免疫耐受期自然轉(zhuǎn)歸相關(guān)影響因素的研究進(jìn)展[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(8):1572-1575.