趙寧，雷勇

(哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院，河北衡水053000)

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，且發(fā)病年齡呈低齡化趨勢(shì)。目前，隨著分子檢測(cè)手段不斷進(jìn)步，腫瘤相關(guān)基因成為癌癥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境而表達(dá)的一種核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其在許多惡性腫瘤癌變前均存在過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，且在腫瘤細(xì)胞新陳代謝、增殖轉(zhuǎn)移及血管形成等方面具有重要作用[1]。乳腺癌易感基因1(BRCA1)作為一種抑癌基因，其結(jié)構(gòu)和功能異常與性激素相關(guān)乳腺癌及卵巢癌發(fā)生具有密切聯(lián)系。子宮內(nèi)膜與乳腺組織相似，均為性激素作用器官，故BRCA1基因可能參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[2]。目前，同時(shí)檢測(cè)HIF-1α及BRCA1表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移影響的研究報(bào)道鮮見(jiàn)。本研究通過(guò)觀察HIF-1α及BRCA1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平，分析兩者在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及二者的相關(guān)性，為臨床診治子宮內(nèi)膜癌提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年6月～2011年5月哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜癌45例(癌癥組)，均術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)。患者年齡(53.21±6.53)歲，均為初診病例，術(shù)前均未接受過(guò)放化療及激素治療。FIGO分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期12例，Ⅲ期5例，Ⅳ期3例；病理組織分化：高分化(G1)21例，中分化(G2)14例，低分化(G3)10例；子宮肌層浸潤(rùn)深度≥1/2 26例，<1/2 19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例；絕經(jīng)22例，未絕經(jīng)23例；術(shù)后隨訪(fǎng)6～72個(gè)月，存活35例。選取同期因子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、子宮肌瘤行子宮切除術(shù)并經(jīng)病理診斷為增生子宮內(nèi)膜者35例(增生組)，年齡(46.81±4.38)歲；行子宮脫垂手術(shù)并經(jīng)病理診斷為正常子宮內(nèi)膜者41例(正常組)，年齡(47.52±5.23)歲。三組均排除其他惡性腫瘤及心血管、血液系統(tǒng)等全身性疾病，其年齡具有可比性，收集其子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 子宮內(nèi)膜組織HIF-1α和BRCA1檢測(cè)方法 采用免疫組化法。標(biāo)本用10%中性多聚甲醛固定，4 μm切片；溫水展片并貼于載玻片上，60 ℃烤片2 h；分別用二甲苯Ⅰ、Ⅱ進(jìn)行脫蠟，各浸泡20 min；依次采用95%、85%、75%無(wú)水乙醇浸泡5 min，共水化2次，蒸餾水沖洗5 min；PBS浸泡5 min后，室溫下用3% H2O2孵育20 min，PBS濕盒中浸泡3次×3 min；放入含檸檬酸鈉溶液中，在95 ℃恒溫水箱中修復(fù)20 min；自然冷卻后PBS濕盒中浸泡3次×3 min，10%山羊血清封閉10 min；滴加稀釋的HIF-1α和BRCA1一抗(工作濃度1∶100)，于4 ℃冰箱保存；棄一抗，PBS濕盒中浸泡3次×3 min，然后滴加含生物素標(biāo)記的二抗；室溫孵育1 h，PBS濕盒中浸泡3次×3 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，于37 ℃恒溫箱中孵育30 min；PBS濕盒中浸泡3次×3 min，進(jìn)行DAB顯色3～5 min；自來(lái)水沖洗后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，沖洗后用0.1%鹽酸乙醇分化；返藍(lán)后依次用75%、85%、95%和100%無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明后晾干；用中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察并獲得圖像。陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，HIF-1α蛋白主要位于細(xì)胞核中，而B(niǎo)RCA1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%計(jì)0分、10%～50%計(jì)2分、51%～80%計(jì)3分、>80%計(jì)4分，細(xì)胞不著色計(jì)0分、呈淺黃色計(jì)1分、呈棕黃色計(jì)2分、呈棕褐色計(jì)3分，兩項(xiàng)得分相加≥1分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)，HIF-1α和BRCA1的相關(guān)性采用Spearmen分析，并用Kaplan-Meier進(jìn)行HIF-1α和BRCA1陽(yáng)性表達(dá)者生存率分析，組間比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HIF-1α、BRCA1表達(dá)比較 HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率在正常組、增生組、癌癥組分別為9.76%(4/41)、40.00%(14/35)、73.33%(33/45)，BRCA1陽(yáng)性表達(dá)率分別為95.12%(39/41)、65.71%(23/35)、31.11%(14/45)，三組間HIF-1α、BRCA1陽(yáng)性表達(dá)率兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 HIF-1α、BRCA1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 與FIGO分期低、肌層浸潤(rùn)深度<1/2、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，F(xiàn)IGO分期高、肌層浸潤(rùn)≥1/2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率升高、而B(niǎo)RCA1陽(yáng)性表達(dá)率降低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α與BRCA1表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α與BRCA1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-1.012，P<0.05)。

表1 HIF-1α、BRCA1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.4 HIF-1α、BRCA1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系 子宮內(nèi)膜癌組織中，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率(72.73%)低于陰性表達(dá)者(91.67%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BRCA1陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率(92.86%)高于BRCA1陰性表達(dá)者(70.97%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是一種實(shí)體惡性腫瘤，而腫瘤新生血管生成與腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境適應(yīng)是維持實(shí)體瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)生長(zhǎng)的兩個(gè)主要因素[3]。HIF-1由α和β亞基組成，其中α亞基主要是氧調(diào)節(jié)亞基和功能亞基，能夠介導(dǎo)糖代謝、細(xì)胞增殖、新生血管形成等靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此，HIF-1α蛋白在維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、促進(jìn)新生血管形成及腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。惡性腫瘤在快速生長(zhǎng)過(guò)程中，其內(nèi)部缺氧可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)HIF-1α，最終引起一系列細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)[5，6]。子宮內(nèi)膜癌與其他惡性腫瘤生長(zhǎng)類(lèi)似，腫瘤細(xì)胞在快速增殖過(guò)程中，易導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)缺氧，進(jìn)而誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)[7]。高杰等[8]研究顯示，子宮內(nèi)膜癌和增生子宮內(nèi)膜組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率高于正常子宮內(nèi)膜組織，在HIF-1α對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下，能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，正常子宮內(nèi)膜、不典型增生內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高。其原因可能為子宮內(nèi)膜癌組織在缺氧條件下，促進(jìn)機(jī)體內(nèi)HIF-1α表達(dá)；HIF-1α在維持子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的能量代謝、腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖等過(guò)程起重要作用，促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌組織的生長(zhǎng)。同時(shí)，分析HIF-1α表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)，發(fā)現(xiàn)隨著患者腫瘤FIGO分期增高、肌層浸潤(rùn)加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高。這表明隨著腫瘤的發(fā)展，組織中HIF-1α表達(dá)逐漸增高，因此HIF-α可作為判斷子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展及預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。梁少?gòu)?qiáng)等[9]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸炎組織和非典型增生組織HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率低于宮頸癌組織，且與宮頸癌臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后生存率相關(guān)，說(shuō)明HIF-1α對(duì)于宮頸癌的診斷及預(yù)后具有重要臨床指導(dǎo)意義。

BRCA1是遺傳性乳腺癌、卵巢癌易感基因，其在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中起重要作用，能夠參與DNA合成及蛋白表達(dá)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞程序性凋亡及維持基因組穩(wěn)定性等過(guò)程。BRCA1基因突變常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞基因不穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)環(huán)境變化敏感性增加；BRCA1基因突變或缺失，會(huì)使機(jī)體DNA損傷監(jiān)測(cè)受到干擾，細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)障礙，最終導(dǎo)致基因表達(dá)產(chǎn)物變化。例如，蛋白缺陷或不能產(chǎn)生蛋白產(chǎn)物，可使抑制腫瘤作用降低或喪失，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[10]。大量研究報(bào)道[11,12]表明，BRCA1在正常組織中高表達(dá)，而在癌前病變組織及癌組織中低表達(dá)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為，乳腺癌、卵巢癌與子宮內(nèi)膜癌均屬于性激素相關(guān)腫瘤，特別是與雌激素表達(dá)異常有關(guān)；BRCA1可能參與雌激素相關(guān)基因的表達(dá)，從而介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展[13]。范余娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1基因突變與BRCA1蛋白表達(dá)下降呈明顯相關(guān)性，且BRCA1蛋白表達(dá)降低與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要聯(lián)系。Segev等[15]研究認(rèn)為，BRCA1基因表達(dá)異?；蛲蛔冋撸瑫?huì)增加其罹患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)。本研究中，正常子宮內(nèi)膜組織、不典型增生內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中BRCA1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，與多數(shù)學(xué)者的觀點(diǎn)一致[16]。分析BRCA1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系顯示，隨著患者腫瘤FIGO分期增高、肌層浸潤(rùn)加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，BRCA1陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低。這表明BRCA1表達(dá)缺失可能與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，BRCA1的缺失能夠反映子宮內(nèi)膜癌的惡性程度。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HIF-1α與BRCA1表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌中呈負(fù)相關(guān)性，即隨著子宮內(nèi)膜癌惡性程度增加，HIF-1α蛋白表達(dá)逐漸增加，而B(niǎo)RCA1蛋白表達(dá)逐漸降低。這表明HIF-1α與BRCA1在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展過(guò)程中可能存在相互作用，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。而生存分析顯示，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率低于陰性表達(dá)者，而B(niǎo)RCA1陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率雖高于BRCA1陰性表達(dá)者，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明兩者均可作為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后判斷的指標(biāo)，以HIF-1α更顯著。

綜上所述，在子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α高表達(dá)而B(niǎo)RCA1低表達(dá)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且與FIGO分期增高、肌層浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過(guò)檢測(cè)HIF-1α、BRCA1表達(dá)，對(duì)子宮內(nèi)膜癌的靶向治療、預(yù)后判斷具有臨床指導(dǎo)作用。

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