蔡潔，王梅

(1江陰市人民醫(yī)院，江蘇江陰214400；2江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

腫瘤是一個全球性的重大公共衛(wèi)生問題，目前在中國乃至世界，惡性腫瘤仍舊是第二大死亡原因，且發(fā)病率還在不斷上升[1]。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，尤其在我國其新發(fā)病率已升至第2位，僅次于肺癌[2]。許多因素導(dǎo)致了胃癌的發(fā)生與發(fā)展，如飲食、吸煙、肥胖、環(huán)境、家族遺傳以及慢性感染等都是主要的影響因素[3,4]。在中國，胃癌的發(fā)病率和病死率居高不下與中國人的飲食習(xí)慣息息相關(guān)，中國人偏愛腌制食品，而腌制品中含有大量致癌物質(zhì)(如亞硝酰胺類化合物)，這是胃癌發(fā)生的關(guān)鍵因素[5]。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是一種人工合成的亞硝基化合物(NOCs)，科研中經(jīng)常用MNNG代替自然界中的亞硝酰胺類化合物來探究其在胃癌形成中的作用[6]。GES-1細(xì)胞系是永生化的胃上皮細(xì)胞系，是經(jīng)SV40病毒轉(zhuǎn)化人胃上皮細(xì)胞得到的，能在體外長期傳代，因此被廣泛用于胃上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及胃癌發(fā)生的相關(guān)研究中[7]。2014年3～ 8月，我們用MNNG短時刺激GES-1細(xì)胞，觀察GES-1細(xì)胞形態(tài)和特性的變化，探討其可能的原因，進(jìn)一步了解MNNG在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 GES-1細(xì)胞購自北京腫瘤防治研究所，化學(xué)致癌物MNNG(美國Sigma公司)；GAPDH抗體(中國康為公司)，E-cadherin抗體(美國Santa Cruz公司)，N-cadherin抗體(美國Abcam公司)，抗鼠Goat anti-mouse IgG (HRP，美國Santa Cruz公司)，抗兔Goat anti-rabbit IgG (HRP，美國Santa Cruz公司)，曝光液(美國Millipore公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶T+E(美國Sigma公司)，RIPA+PMSF(美國Vazyme公司)，二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司)，蛋白預(yù)染Marker(美國MBI公司)，結(jié)晶紫染料(中國艾然公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將GES-1細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)生長情況每隔2～3 d換培養(yǎng)液1次；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到近80%時，按1∶3比例傳代，然后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MNNG短時刺激GES-1細(xì)胞 用適量DMSO溶解MNNG粉末，配成0.2 mol/L的MNNG溶液；用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋MNNG溶液至1×10-5mol/L，濾器過濾。預(yù)先將適量的GES-1細(xì)胞種于6孔板中，培養(yǎng)24 h；加入1×10-5mol/L的MNNG溶液避光刺激0、4、8、12 h，接著撤去MNNG；用PBS緩沖液洗滌至少3次，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 分別取GES-1細(xì)胞和經(jīng)MNNG作用不同時間點(diǎn)的GES-1細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，并拍照保存。

1.2.4 細(xì)胞增殖活性觀察 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。將GES-1細(xì)胞和MNNG短時刺激的GES-1細(xì)胞消化計數(shù)，按1 000個細(xì)胞盡量均勻地種于直徑3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；培養(yǎng)12 d后，PBS緩沖液洗滌至少3次；加4%多聚甲醛固定30 min，PBS緩沖液再洗滌3次；加結(jié)晶紫染色15 min，繼續(xù)用PBS緩沖液洗滌干凈；最后用照相機(jī)拍照，數(shù)出每個細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。將GES-1細(xì)胞和MNNG短時刺激的GES-1細(xì)胞同時用胰酶消化，離心后用無血清RPMI1640培養(yǎng)液懸浮，計數(shù)后配成5×105/mL的細(xì)胞懸液。在24孔Transwell板下室加600 μL含10% FBS的RPMI1640營養(yǎng)液，上室內(nèi)加入200 μL已配好的均勻細(xì)胞懸液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h；取出上室，用4%多聚甲醛固定，棉簽擦拭小室內(nèi)未遷出的細(xì)胞；結(jié)晶紫染色15 min，PBS緩沖液洗凈染液；在倒置顯微鏡的低倍鏡下拍照，每孔隨機(jī)拍攝6個視野，計數(shù)每個視野的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。以穿膜細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移能力，數(shù)量越多遷移能力越強(qiáng)。

1.2.6 細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin檢測 采用Western blotting法。收集GES-1細(xì)胞和經(jīng)MNNG作用不同時間點(diǎn)的GES-1細(xì)胞，離心后棄去上清；在細(xì)胞沉淀中加入適量蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF(250∶1)，每5 min在振蕩器上劇烈震蕩1 min，共5次；置于預(yù)先預(yù)冷至4 ℃的高速離心機(jī)中，以12 000 r/min離心15 min；吸取上清液并記錄其具體體積，用核酸蛋白測定儀檢測每組上清的總蛋白濃度。再向上清中加入是其總體積1/4的Loading Buffer，混勻，沸水煮5 min，使蛋白變性。配置8%的聚丙烯酰胺凝膠，根據(jù)所測各組蛋白的濃度，計算出上樣體積；按順序加樣后，恒壓電泳，恒流轉(zhuǎn)膜2 h，封閉1 h；用特異性單克隆抗體(E-cadherin、N-cadherin和GAPDH)孵育，4 ℃過夜。次日，用TBST洗膜液洗膜，孵育二抗；GAPDH用HRP標(biāo)記抗鼠二抗孵育，E-cadherin和N-cadherin用HRP標(biāo)記的抗兔二抗；37 ℃孵育1 h，再洗膜。最后，以曝光液為介質(zhì)，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，保存圖片；用Photoshop分析條帶的灰度值，以灰度值大小來表示蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MNNG短時刺激對GES-1細(xì)胞形態(tài)的影響 與正常GES-1細(xì)胞相比，MNNG刺激后的細(xì)胞更大，更扁平，邊緣不清晰，形狀不一，有些細(xì)胞成團(tuán)塊狀生長；并且隨著刺激時間的延長，部分細(xì)胞呈紡錘形或不規(guī)則形，比未刺激細(xì)胞更加細(xì)長。

2.2 MNNG短時刺激對GES-1細(xì)胞增殖能力的影響 GES-1細(xì)胞經(jīng)MNNG刺激0、4、8、12 h時，其克隆數(shù)分別為(82.00±1.16)、(89.67±3.28)、(81.33±1.76)、(85.67±1.45)個，各時點(diǎn)GES-1細(xì)胞克隆數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 MNNG短時刺激對GES-1細(xì)胞遷移能力的影響 GES-1細(xì)胞經(jīng)MNNG刺激0、4、8、12 h時，其穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(83.00±2.89)、(149.00±5.20)、(265.70±6.06)、(491.00±8.74)個，刺激時間越長穿膜細(xì)胞數(shù)越多(P均<0.05)。

2.4 MNNG短時刺激對GES-1細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的影響 隨著MNNG刺激時間延長，GES-1細(xì)胞E-cadherin表達(dá)逐漸降低而N-cadherin表達(dá)逐漸升高(P均<0.05)。見表1。

表1 MNNG短時刺激對GES-1細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的影響

注：與刺激0 h時相比,*P<0.05。

3 討論

研究認(rèn)為，胃癌的病因非常復(fù)雜，至今其發(fā)生的具體病因和相關(guān)機(jī)制仍不清楚，但飲食習(xí)慣一定是一個相當(dāng)重要的影響因素。NOCs被認(rèn)為是強(qiáng)有力的致癌物質(zhì)，也是胃癌發(fā)生的重要危險因素之一，人工合成的MNNG是NOCs中典型的代表。在國內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究中，該化合物是常用于動物模型的誘導(dǎo)劑和致癌物，并已成功用MNNG在動物體內(nèi)建立胃癌模型[6]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，將一定濃度的MNNG避光作用于GES-1細(xì)胞，24 h后撤去MNNG溶液，這樣高濃度長時間受刺激的GES-1細(xì)胞發(fā)生大量死亡，少量殘存的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)增殖，成為經(jīng)MNNG誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化后GES-1細(xì)胞株，即MC細(xì)胞株。MC細(xì)胞常被作為胃癌癌前病變細(xì)胞的體外模型，被廣泛用于胃癌發(fā)生機(jī)制的研究[9]。但是，在實(shí)際生活或模擬實(shí)驗(yàn)中，一次性接受高濃度、長時間NOCs刺激的可能性比較小，通常都是低濃度短時間的刺激，而這類研究并不多。所以，本研究降低了MNNG濃度和刺激時間，側(cè)重于低濃度短時處理GES-1細(xì)胞。在該濃度和時間作用下，GES-1細(xì)胞的活性基本不受影響，胞體變大扁平，輪廓不清，周邊多呈毛刺狀；有些細(xì)胞兩端變細(xì)長，甚至呈紡錘形；大部分細(xì)胞生長無序，排列紊亂，成團(tuán)塊狀生長，有類似腫瘤細(xì)胞的生長和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。但是，通過平板克隆實(shí)驗(yàn)，比較刺激后的GES-1細(xì)胞與正常GES-1細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)并無明顯差別。這可能是因?yàn)榇碳ちΧ扔邢蓿€未達(dá)到影響細(xì)胞增殖能力的程度。以上結(jié)果表明，低濃度短時MNNG刺激的GES-1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了一定變化，有惡性轉(zhuǎn)化的趨勢，但是其增殖能力還未有顯著變化。

EMT是指在特定的生理或病理條件下，上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[10]。在此過程中，上皮細(xì)胞發(fā)生質(zhì)變，細(xì)胞失去極性，細(xì)胞間黏附性減弱，但獲得能動性和侵襲性[11]。EMT表型的獲得可促進(jìn)細(xì)胞的遷移，破壞上皮樣結(jié)構(gòu)體系，是腫瘤發(fā)生發(fā)展乃至腫瘤干性獲取的重要特征[12]。因此，EMT的異常活化在許多腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等。有報道[13]稱，MNNG預(yù)處理的GES-1細(xì)胞和MC細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)樣變化，且遷移能力增強(qiáng)；經(jīng)CCl2刺激后變化加劇，且獲得了EMT表型。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)MNNG低濃度短時刺激的GES-1細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，再結(jié)合考慮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，大膽提出MNNG使GES-1細(xì)胞發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化的假設(shè)。

在EMT轉(zhuǎn)化過程中,E-cadherin是關(guān)鍵的傳遞者，能通過加強(qiáng)細(xì)胞間黏附性來維持細(xì)胞極性并且組織上皮細(xì)胞排列[14]，還參與細(xì)胞內(nèi)信號傳遞，從而控制細(xì)胞成熟、分化、生長和能動性，故而可作為侵襲抑制基因。EMT異常活化會使E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而向間質(zhì)樣蛋白N-cadherin轉(zhuǎn)化;N-cadherin在EMT過程中表達(dá)上調(diào)[14]，其依賴于細(xì)胞環(huán)境，促進(jìn)黏附和遷移；但這兩種特性受N-cadherin基因的不同部位調(diào)控，故而是相互獨(dú)立的。本研究結(jié)果顯示，MNNG短時刺激GES-1細(xì)胞后，細(xì)胞E-cadherin表達(dá)驟減，而N-cadherin表達(dá)急劇升高。這與假設(shè)相符，本研究所結(jié)果表明MNNG的確使GES-1細(xì)胞發(fā)生了EMT。

越來越多的證據(jù)顯示，腫瘤的各級進(jìn)程都可能觸發(fā)EMT表型；胃癌的發(fā)生及其惡性特征就與E-cadherin突變相關(guān)，而N-cadherin表達(dá)與侵襲性胃癌相關(guān)[15]，通過抑制EMT轉(zhuǎn)化能增強(qiáng)化療藥物的療效[16]。因此，EMT在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥、預(yù)后以及復(fù)發(fā)等階段都起到關(guān)鍵作用。目前，引起腫瘤進(jìn)程中EMT發(fā)生的機(jī)制有很多，比較被認(rèn)可的是細(xì)胞因子發(fā)揮關(guān)鍵性作用，細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或者激活各種信號通路來誘導(dǎo)EMT發(fā)生。前列腺癌細(xì)胞受可溶性因子人胰島素樣生長因子(IGF1)刺激后，細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB1)表達(dá)上調(diào)，從而引起EMT轉(zhuǎn)化[17]。白細(xì)胞介素6和轉(zhuǎn)化生長因子β通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail和p-Smad3，同時活化JAK/STAT3通路來增強(qiáng)肺癌中EMT轉(zhuǎn)化[18]。另外，Wnt/β-catenin信號通路和PI3K/AKT信號通路在胃癌的EMT發(fā)生中也扮演重要角色[15]。本研究中MNNG促使胃上皮細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的機(jī)制還不清楚，今后也可以從細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子著手進(jìn)行下一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)致癌物MNNG短時刺激胃上皮細(xì)胞后，胃上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，并且發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化，但誘導(dǎo)EMT發(fā)生的具體原因和機(jī)制還不清楚，這是今后需繼續(xù)探索和研究的方向。

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[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2018[J]. CA Cancer J Clini, 2018,68 (1): 7-30.

[2] Chen W, Zheng R. Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115.

[3] Aggarwal BB, Gehlot P. Inflammation and cancer: how friendly is the relationship for cancer patients[J]. Curr Opin Pharmacol, 2009,9(4):351-369.

[4] Crew KD, Neugut AI. Epideiology of gastric cancer[J]. World J Gastroenterology,2006,12 (3):354-362.

[5] Abe M, Yamashita S, Kuramoto T, et al. Global expression analysis of N -methyl- N′ -nitro- N -nitrosoguanidine-induced rat stomach carcinomas using oligonucleotide microarrays[J]. Carcinogenesis, 2003,24(5):861-867.

[6] Raphael KR, Sabu M, Kumar KH, et al. Inhibition of N-Methyl N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) induced gastric carcinogenesis by Phyllanthus amarus extract[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2006,7 (2):299.

[7] 柯楊,寧濤,王冰,等.人胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1的建立及其生物學(xué)特性[J].中華腫瘤雜志,1994,16(1):7-9.

[8] 孫振卿,閆慧明,賈彬,等.從形態(tài)及功能研究MNNG誘導(dǎo)GES-1永生化細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2012,22(22):14-18.

[9] 李軍祥,王志斌,朱陵群,等.三七提取物含藥血清對MNNG轉(zhuǎn)化后GES-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2008,6(8):817-820.

[10] Savagner P. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) phenomenon [J]. Ann Oncol, 2010,21(7):89.

[11] Savagner P. Epithelial-mesenchymal transitions: from cell plasticity to concept elasticity[J]. Curr Top Dev Biol, 2015,112:273.

[12] Voulgari A, Pintzas A. Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis: mechanisms, markers and strategies to overcome drug resistance in the clinic[J]. Biochim Biophys Acta, 2009,1796(2):75.

[13] Cai J, Wang M, Zhu M, et al. N-methyl-N-nitro-N′-nitrosoguanidine induces the expression of CCR2 in human gastric epithelial cells promoting CCl2-mediated migration[J]. Mol Med Rep, 2016,13(2):1083-1090.

[14] Zhang H, Liu L, Wang Y, et al. KLF8 involves in TGF-beta-induced EMT and promotes invasion and migration in gastric cancer cells[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2013,139 (6):1033-1042.

[15] Peng Z, Wang CX, Fang EH, et al. Role of epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer initiation and progression[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(18):5403.

[16] Jiang JH, Liu C,Cheng H, et al. Epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer: Is it a clinically significant factor[J]. Biochim Biophys Acta, 2015,1855(1): 43-49.

[17] Chen CL, Mahalingam D, Osmulski P, et al. Single-cell analysis of circulating tumor cells identifies cumulative expression patterns of emt-related genes in metastatic prostate cancer [J]. Prostate, 2013,73(8): 813-826.

[18] Liu RY, Zeng Y, Lei Z, et al. JAK/STAT3 signaling is required for TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cells[J]. Int J Oncol, 2014,44 (5):1643-1651.