王燕，靳欽，劉穎，田薇

(南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，病死率居惡性腫瘤的第五位[1]。2016年，中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示我國胃癌的發(fā)病率及病死率率高居惡性腫瘤第二位[2]。但胃癌早期臨床癥狀不典型，多數(shù)患者就診時己處于中晚期。目前臨床尚無有效治療方法。研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找影響預(yù)后的腫瘤分子標(biāo)志物，是目前的研究熱點(diǎn)。

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)合至起源識別復(fù)合物1(HBO1)是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶MYST家族中的重要一員，含611個氨基酸，定位于17號染色體上(17q21.3)，是組蛋白特異的乙酰轉(zhuǎn)移酶，在結(jié)合至起源識別復(fù)合物1(ORC1)上首次被發(fā)現(xiàn)[3]。HBO1具有典型的激酶催化活性區(qū)，在HBO復(fù)合體中起催化作用[4]。HBO1可與雄激素受體(AR)、孕激素受體(PR)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶11B(CDK11B)、微染色體維持復(fù)合物2(MCM2)、ORC1等蛋白相互作用，參與細(xì)胞復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的執(zhí)行與調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、脂肪形成，甚至導(dǎo)致淋巴瘤等腫瘤的發(fā)生[4,5]。同時HBO1還能與腫瘤抑制因子p53結(jié)合并抑制其功能[6]。目前關(guān)于HBO1在胃癌組織中的表達(dá)報道較少。我們觀察了胃癌組織中HBO1的表達(dá)變化，并分析其與臨床病理參數(shù)、患者預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1　 資料與方法

1.1臨床資料選擇南通大學(xué)附屬醫(yī)院2009年 1 月～2011年12月收治的胃癌患者125例，男89例、女36例，年齡21～75( 55.24 ± 17.16) 歲；均行胃癌切除手術(shù)，術(shù)中留取胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織標(biāo)本。患者術(shù)前均未接受過放療或化療。所有標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有患者均臨床資料完整及電話隨訪記隨訪率100%，隨訪截至2016年6月。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要試劑鼠抗人HBO1購自Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自Sigma公司、TRIzol試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織HBO1蛋白檢測采用免疫組化法。取胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織，免疫組織化學(xué)染色后，將切片置于高倍顯微鏡下觀察胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織表達(dá)HBO1的情況。HBO1定位于細(xì)胞核中，測算HBO1的陽性表達(dá)率。

1.4 胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織HBO1 mRNA檢測采用qRT-PCR法。將胃癌、癌旁組織及正常胃組織用玻璃研磨器研磨，TRIzol法提取總RNA，測其濃度和純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參，用PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增，特異性引物序列：HBO1上游引物5′-TTTTGGCCGCTATGAACTG -3′，下游引物5′-GGAGGATTGTCTGGCTCTTC -3′，產(chǎn)物大小為755 bp。β-actin上游引物5′-AAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3′，下游引物5′-GTGGTACGACCAGAGGCATAC-3′，產(chǎn)物大小為336 bp。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，40次循環(huán)，72 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCt表示HBO1 mRNA 相對表達(dá)量。實(shí)驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

2　結(jié)果

2.2HBO1表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系HBO1表達(dá)與胃癌腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)前血CEA水平有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡及組織類型無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3HBO1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier統(tǒng)計分析顯示，HBO1高表達(dá)患者的總生存率降低(P<0.05)。單因素生存分析顯示， HBO1表達(dá)、腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)前血CEA值與胃癌患者的預(yù)后有關(guān)(P均<0.05，而與年齡、性別及組織類型等無關(guān)(P均>0.05)，多因素分析顯示HBO1表達(dá)、腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P均<0.05)。

3　 討論

HBO1是MYST家族的一員，為核定位蛋白，在細(xì)胞核中有不同的亞結(jié)構(gòu)，它最初被確定為起源識別復(fù)合物(ORC)的伴侶，因其含有保守的MYST結(jié)構(gòu)域，可乙?；M蛋白和調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)，在小鼠胚胎干細(xì)胞中，Myst2/Kat7/HBO1三個蛋白相互作用參與H3和H4組蛋白的乙酰[7]，在酵母中，Sas2作為HBO1的同源蛋白參與基因的沉默。另外，HBO1也與細(xì)胞周期有關(guān)[8]，有可能參與了細(xì)胞周期的調(diào)控。HBO1不僅對組蛋白H3和H4具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性[7,9～12]，對一些非組蛋白如ORC2、MCM2、CDC6等也有一定的作用[13]。在胚胎細(xì)胞中，HBO1的缺失可引起E10.5位點(diǎn)的H3K14廣泛乙?；瑥亩古咛サ闹滤缆式档蚚11]。

注：a： 含1例腺鱗癌；b:含4例黏液腺癌。

因HBO1具有廣譜的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄激活中也發(fā)揮了多功能蛋白的作用。在DNA 復(fù)制方面，HBO1可以通過兩種方式來調(diào)節(jié)：①乙?；疕4K5/8/12來促進(jìn)復(fù)制前復(fù)合物(Pre-RC)的形成[11]；②乙酰化H3K14來促進(jìn)CDC45的裝載以激活S期中的DNA復(fù)制[12]。在轉(zhuǎn)錄激活方面，首先，HBO1可結(jié)合到復(fù)制開始位點(diǎn)和基因編碼區(qū)，與ING4 /5、hEaf6 和JADE1/2/3形成復(fù)合物，在染色質(zhì)基因編碼區(qū)通過復(fù)合物中多個鋅指結(jié)構(gòu)與組蛋白H3尾相互作用，通過ING4/5和JADE1S調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始和周期的延長[14]；其次，研究顯示，HBO1可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，在猴CV1細(xì)胞中，孕酮的受體在的 MYST結(jié)構(gòu)域作用下轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，其同源基因chameau (Chm) 可調(diào)控Hox基因沉默的突變進(jìn)而起到轉(zhuǎn)錄的作用，同時Chm能在HEK293細(xì)胞中協(xié)同 DFos和DJun 促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，在這個過程中 H4K16 乙?；乃揭矔黾覽15]，另外HBO1可與BRPF3協(xié)同調(diào)節(jié)復(fù)制起點(diǎn)的激活和組蛋白H3K14的乙?；痆12]。

HBO1的過表達(dá)可引起細(xì)胞過度復(fù)制活化、促進(jìn)細(xì)胞增殖，進(jìn)而引起各種腫瘤，如睪丸的生殖細(xì)胞腫瘤，乳腺癌和卵巢漿液性癌等[16]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)HBO1/KAT7/MYST2通過泛素化促進(jìn)ERα的蛋白酶體依賴性降解，并參與組蛋白廣泛乙?；NA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞增殖，同時HBO1是泛素化ERα的另一種ERα共激活因子[17]，這些跟乳腺癌的發(fā)病相關(guān)； HBO1與AR間存在相互作用關(guān)系，說明HBO1也與前列腺癌的發(fā)展有關(guān)；HBO1存在于腫瘤抑制物 ING4和ING5中，其乙?；D(zhuǎn)移酶活性含有增強(qiáng) p53的轉(zhuǎn)錄活性，ING4 能阻止體外培養(yǎng)的細(xì)胞失去接觸抑制，在多種人腫瘤細(xì)胞株中ING4 處于失活狀態(tài)，在小鼠模型中，ING4是腦膠質(zhì)瘤和血管生成的有效抑制物[18]，這可能與HBO1有關(guān)。HBO1編碼區(qū)域已經(jīng)被確定為一個共同的逆轉(zhuǎn)錄病毒整合位點(diǎn)，可與轉(zhuǎn)錄相關(guān)病毒結(jié)合，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，在鼠中能夠?qū)е鹿撬璋籽『土馨土鯷19]；另外HBO1可與不同的受體結(jié)合，對腫瘤性疾病的發(fā)生及進(jìn)展產(chǎn)生不同的促進(jìn)或抑制作用[20]。

魯列斯三角形可以緊緊地嵌在一個正方形內(nèi)部，即正方形的各邊上都有魯列斯三角形邊緣上的點(diǎn)，如圖2．設(shè)魯列斯三角形的頂點(diǎn)A、B、C間距離為1cm，則正方形邊長也是1cm．魯列斯三角形三個頂點(diǎn)沿著正方形邊界行進(jìn)一周的過程中，正三角形ABC的外心T也在運(yùn)動．

綜上所述， 胃癌組織中HBO1高表達(dá)，其可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，HBO1是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。

參考文獻(xiàn)：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[3] Iizuka M, Stillman B. Histone acetyltransferase HBO1 interacts with the ORC1 subunit of the human initiator protein[J]. J Biol Chem, 1999,274(33):23027-23034.

[4] Foy RL, Song IY, Chitalia VC, et al. Role of Jade-1 in the histone acetyltransferase (HAT) HBO1 complex[J]. J Biol Chem, 2008,283(43):28817-28826.

[5] Johmura Y, Osada S, Nishizuka M, et al. FAD24 acts in concert with histone acetyltransferase HBO1 to promote adipogenesis by controlling DNA replication[J]. J Biol Chem, 2008,283(4):2265-2274.

[6] Iizuka M, Sarmento OF, Sekiya T, et al. Hbo1 Links p53-dependent stress signaling to DNA replication licensing[J]. Mol Cell Biol, 2008,28(1):140-153.

[7] Pardo M, Yu L, Shen S, et al. Myst2/Kat7 histone acetyltransferase interaction proteomics reveals tumour-suppressor Niam as a novel binding partner in embryonic stem cells[J]. Sci Rep, 2017,7(1):8157.

[8] Zong H, Li Z, Liu L, et al. Cyclin-dependent kinase 11(p58) interacts with HBO1 and enhances its histone acetyltransferase activity[J]. FEBS Lett ,2005,579(17):3579-3588.

[9] Avvakumov N, Lalonde ME, Saksouk N, et al. Conserved molecular interactions within the HBO1 acetyltransferase complexes regulate cell proliferation[J]. Mol Cell Biol, 2012,32(3):689-703.

[10] Lalonde ME, Avvakumov N, Glass KC, et al. Exchange of associated factors directs a switch in HBO1 acetyltransferase histone tail specificity[J]. Genes Dev, 2013,27(18):2009-2024.

[11] Kueh AJ, Dixon MP, Voss AK, et al. HBO1 is required for H3K14 acetylation and normal transcriptional activity during embryonic development[J]. Mol Cell Biol, 2011,31(4):845-860.

[12] Feng Y, Vlassis A, Roques C, et al. BRPF3-HBO1 regulates replication origin activation and histone H3K14 acetylation[J]. EMBO J, 2016,35(2):176-192.

[13] Iizuka M, Matsui T, Takisawa H, et al. Regulation of replication licensing by acetyltransferase Hbo1[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(3):1098-1108.

[14] Saksouk N, Avvakumov N, Champagne KS, et al. HBO1 HAT complexes target chromatin throughout gene coding regions via multiple PHD finger interactions with histone H3 tail[J]. Mol Cell, 2009,33(2):257-265.

[15] Miotto B, Sagnier T, Berenger H, et al. Chameau HAT and DRpd3 HDAC function as antagonistic cofactors of JNK/AP-1-dependent transcription during Drosophila metamorphosis[J]. Genes Dev, 2006,20(1):101-112.

[16] Iizuka M, Takahashi Y, Mizzen CA, et al. Histone acetyltransferase Hbo1: catalytic activity, cellular abundance, and links to primary cancers[J]. Gene, 2009,436(1-2):108-114.

[17] Iizuka M, Susa T, Tamamori-Adachi M, et al. Intrinsic ubiquitin E3 ligase activity of histone acetyltransferase Hbo1 for estrogen receptor alpha[J]. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 2017,93(7):498-510.

[18] Kim S, Chin K, Gray JW, et al. A screen for genes that suppress loss of contact inhibition: identification of ING4 as a candidate tumor suppressor gene in human cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(46):16251-16256.

[19] Suzuki T, Shen H, Akagi K, et al. New genes involved in cancer identified by retroviral tagging[J]. Nat Genet, 2002,32(1):166-174.

[20] Yagi T, Inoue N, Yanai A, et al. Prognostic significance of geminin expression levels in Ki67-high subset of estrogen receptor-positive and HER2-negative breast cancers[J]. Breast Cancer, 2016,23(2):224-230.