袁曉鳳,袁修凱,周芳
(1中國人民解放軍第97醫(yī)院,江蘇徐州 221000;2睢寧中醫(yī)院)
臍帶間充質干細胞(hUC-MSCs)是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞[1,2]。hUC-MSCs取材方便,易于分離培養(yǎng),低免疫原性低,且遺傳性狀穩(wěn)定[3,4],故被認為是組織工程的理想種子細胞。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),間充質干細胞(MSCs)和腫瘤之間具有密切的聯(lián)系[5,6],卵巢癌是婦產科最常見的惡性腫瘤之一,由于該腫瘤起病比較隱匿,缺乏特異表現(xiàn),在臨床上確診時大多已經晚期,是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中病死率最高的腫瘤。本研究以卵巢癌細胞株SKOV3為研究對象,觀察了卵巢癌細胞株SKOV3在hUC-MSCs培養(yǎng)液hUC-MSCs培養(yǎng)液中的增殖、凋亡和遷移情況?,F(xiàn)報告如下。
1.1材料低糖DMEM和高糖DMEM購自Gibco公司;血清購自Excell公司;小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(mAb)、小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb和小鼠抗大鼠Bax mAb購自Immuway公司;MTT四甲基偶氮唑藍試劑購自碧云天生物技術公司;成骨、成脂誘導液以及堿性磷酸酶(ALP)和油紅O染色液購自廣州賽業(yè)公司;凋亡試劑盒購自Sigma公司;Transwell小室、6孔板、25 cm2細胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司;倒置顯微鏡購自Nikon公司;二氧化碳孵育箱購自Thermo公司。
1.2hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)及hUC-MSCs細胞培養(yǎng)液的制備在超凈工作臺中無菌操作,用PBS沖洗掉臍帶表明殘留的血液,在含雙抗(青/鏈霉素,終濃度為100 U/mL)的營養(yǎng)液中浸泡約15 min,隨后去掉臍帶組織中的動脈和靜脈,將臍帶組織剪成約1 mm3的小塊,小心均勻的貼在10 mm×35 mm小皿中并加入含有雙抗的L-DMEM培養(yǎng)液,放在37 ℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng),每3 d換液1次。培養(yǎng)7~10 d可見纖維樣的細胞從臍帶組織塊中爬出,待細胞融合到80%時消化傳代。經過3次傳代純化后收集細胞備用。將hUC-MSCs細胞以5×105個細胞密度,接種于培養(yǎng)瓶中,待細胞融合度達到80%時,更換無血清的L-DMEM培養(yǎng)液,24 h后提取培養(yǎng)液,0.22 μm濾膜過濾。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 SKOV3細胞分組及hUC-MSC細胞培養(yǎng)液應用 將體外培養(yǎng)的SKOV3細胞分為觀察1組、觀察2組和對照組。觀察1、2組分別用10%、20%的hUC-MSC培養(yǎng),對照組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.4各組SKOV3細胞增殖情況觀察 ①MTT法。取對數(shù)期生長的SKOV3接種于96孔板,每孔2 000個細胞,然后每孔加入200 μL H-DMEM營養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜后,次日換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液(分別計為觀察1組、觀察2組)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入20 μL MTT,37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)4 h后棄掉上清培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO溶液,避光振蕩15 min,酶標儀檢測490 nm處的吸光度值。每個觀察組設4個復孔。以未經hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細胞作為對照組。實驗重復3次。②細胞平板克隆實驗。取對數(shù)期生長的SKOV3細胞按500/孔接種于小皿中,用H-DMEM營養(yǎng)液培養(yǎng)過夜后,換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液(分別計為觀察1組、觀察2組),每3天換液1次,第7天棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌3遍后4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3遍,結晶紫染色30 min后PBS沖洗3遍,拍照并記錄細胞克隆個數(shù)。以未經hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細胞作為對照組。實驗重復3次。
1.5各組SKOV3細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。收集對數(shù)生長期的SKOV3細胞,0.25%胰酶消化計數(shù),按每孔加入3×104個細胞于6孔板內,次日棄去培養(yǎng)液,換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細胞并計數(shù)每管1×106個細胞,然后滴加PI和Annexin-V-FITC進行雙染,在4 ℃避光染色30 min,過濾后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。以未經hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細胞為對照組。
1.6各組SKOV3細胞遷移情況觀察 ①劃痕實驗。取對數(shù)期生長的SKOV3細胞按1×105/孔接種于小皿中,置于37 ℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng)到細胞融合度>80%,棄去培養(yǎng)液,用無血清的H-DMEM營養(yǎng)液沖洗3遍,用200 μL移液槍槍頭在小皿中劃出1條直線,再用無血清的H-DMEM營養(yǎng)液沖洗,換10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液(分別為觀察1組、觀察2組),在顯微鏡下觀察并拍照記錄0 h和48 h細胞遷移情況,計算0 ~48 h劃痕愈合率。劃痕愈合率=(0 h寬度-48 h寬度)/0 h寬度×100%。以未經hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細胞為對照組。②Transwell遷移實驗。用10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液預處理SKOV3細胞24 h,分別為觀察1組、觀察2組。以未經hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細胞為對照組。收集各組SKOV3細胞,用無血清H-DMEM營養(yǎng)液培養(yǎng)液重懸后,在Transwell小室中加入細胞懸液按200 μL,在下室中加入800 μL含10%NBS的H-DMEM營養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2孵箱內培養(yǎng)12 h后,取出Transwell小室,吸去上室內的液體,棉簽擦去小室內未遷移的細胞,用PBS洗3遍,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3遍,結晶紫染色30 min后PBS沖洗3遍,顯微鏡下隨機選取視野拍照,計數(shù)每個視野下的細胞數(shù)。
1.7各組SKOV3細胞Bcl-2和Bax蛋白檢測采用Western blotting法。用10%、20%的hUC-MSCs培養(yǎng)液預處理SKOV3細胞24 h,分別計為觀察1組、觀察2組。以未經hUC-MSCs培養(yǎng)液處理的SKOV3細胞為對照組。收集各組SKOV3細胞在RIPA緩沖液中裂解并收集蛋白,用12%SDS-PAGE電泳分離(最佳分離范圍12~60 kD),隨后電轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別加入抗小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb(1∶200)和Bax mAb(1∶200)以及內參照GAPDH抗體(1∶5 000),4 ℃孵育過夜,用TBS/T洗3遍,加入HRP標記的羊抗小鼠IgG(1∶2 000),室溫孵育1 h,用TBS/T洗3遍,最后加入ELC試劑,拍照分析。Bcl-2、Bax蛋白表達量以Bcl-2和Bax條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示。
2.1各組細胞增殖活性比較①觀察1組、觀察2組、對照組吸光度值分別為0.50±0.09、0.80±0.06、0.21±0.04。觀察1、2組吸光度值均大于對照組(P均<0.05),且觀察2組大于觀察1組(P<0.05)。②觀察1組、觀察2組、對照組細胞克隆數(shù)分別為(311.00±17.52)、(476.33±20.60)、(147.00±9.17)個,觀察1、2組細胞克隆數(shù)明顯高于對照組(P均<0.05),且觀察2組高于觀察1組(P<0.05)。
2.2各組細胞凋亡率比較 觀察1組、觀察2組、對照組細胞凋亡率分別為10.98%±1.28%、5.50%±0.67%、17.97%±1.50%。觀察1、2組細胞凋亡率低于對照組(P均<0.05),且觀察2組低于觀察1組(P<0.05)。
2.3各組細胞遷移能力比較 ①觀察1組、觀察2組、對照組細胞劃痕愈合率分別為114.50%±19.09%、138.50%±0.71%、108.50%±14.85%。觀察1、2組細胞劃痕愈合率高于對照組(P均<0.05),且觀察2組高于觀察1組(P<0.05)。②觀察1組、觀察2組、對照組穿膜細胞數(shù)分別為155.00±151.50、335.67±344.50、151.33±145.50。觀察1、2組穿膜細胞數(shù)高于對照組(P均<0.05),且觀察2組高于觀察1組(P<0.05)。
2.4各組細胞Bcl-2、Bax表達比較觀察1組、觀察2組、對照組細胞Bcl-2相對表達量分別為0.48±0.47、0.62±0.63、0.84±0.86,Bax相對表達量分別為0.75±0.78、0.64±0.63、0.58±0.56。觀察1、2組細胞Bcl-2相對表達量高于對照組(P均<0.05),且觀察2組高于觀察1組(P<0.05);觀察1、2組細胞Bax相對表達量低于對照組(P均<0.05),且觀察2組低于觀察1組(P<0.05)。
hUC-MSCs具有取材方便來源廣泛、免疫原性低、分泌多種細胞因子和免疫調節(jié)能力強等特點,是目前研究最多最深入的干細胞之一[7,8],hUC-MSCs有望成為理想的細胞工程“種子細胞”。hUC-MSCs獲取的主要方法是貼壁法和酶消化法,但由于酶消化法操作步驟多,污染風險大以及對細胞有傷害。本研究通過臍帶組織貼壁法分離hUC-MSCs,傳代培養(yǎng)獲得純化的hUC-MSCs。
越來越多研究[9~11]表明腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用。MSCs能夠受到炎癥因子的趨化遷移到炎癥組織處并對其進行修復[12],目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的微環(huán)境與炎癥周圍的微環(huán)境有許多相似之處,MSCs同樣能夠被招募到實質腫瘤部位構成其微環(huán)境,微環(huán)境中的MSCs能夠進一步成為腫瘤相關成纖維細胞,并參與腫瘤生長、侵潤轉移和耐藥等過程。研究人員發(fā)現(xiàn),hUC-MSCs培養(yǎng)液對腫瘤細胞的增殖和遷移有促進作用[13],并推測這方面的作用可能是通過hUC-MSCs分泌的細胞因子實現(xiàn)的。本研究結果顯示,與對照組相比,觀察1、2組SKOV3細胞增殖和遷移能力增強,細胞凋亡率降低,且觀察2組比觀察1組顯著,提示hUC-MSCs通過旁分泌途徑促進了SKOV3細胞的增殖和遷移并抑制其凋亡。McLean等[14]在分離腫瘤相關MSCs時發(fā)現(xiàn)有90%的原發(fā)性卵巢癌患者存在腫瘤相關MSCs,但是這些MSCs沒有致癌性,具有正常的核型和細胞表面標記以及多向分化潛能增強。Chu等[15]發(fā)現(xiàn)從健康人網(wǎng)膜中分離的脂肪來源MSCs能夠明顯促進卵巢癌細胞生長和遷移。另外,So等[16]發(fā)現(xiàn),卵巢癌細胞與其微環(huán)境中的MSCs相互影響,MSCs通過分泌IL-6作用卵巢癌細胞發(fā)生上皮間質轉化,使卵巢癌細胞獲得間質特性,此外還分泌基質金屬蛋白酶增強腫瘤的侵襲和轉移能力。不過也有研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠抑制卵巢癌的增殖遷移能力[17,18],這些結果的不一致可能是由于MSCs來源不同以及所使用的卵巢癌細胞株不完全一致。
Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中重要成員,Bcl-2發(fā)揮促增殖和抑制下游凋亡途徑的激活作用,而Bax能夠與Bcl-2形成二聚體拮抗Bcl-2的促增殖作用,從而激活下游凋亡途徑。正常情況下,Bax和Bcl-2相互協(xié)調維持平衡,但如果受到體內或是外部的刺激,將打破這個平衡導致機體功能紊亂。本研究結果顯示,與對照組相比,觀察1、2組SKOV3細胞Bcl-2表達升高,Bax表達下降,且觀察2組比觀察1組明顯,提示在hUC-MSCs細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng),SKOV3細胞Bax的表達下調,Bcl-2表達下調,這可能是與各組細胞細胞增殖、凋亡、遷移能力的變化有關。
參考文獻:
[1] Davies JE, Walker JT, Keating A. Concise review: Wharton′s Jelly: the rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells[J]. Stem Cells Transl Med, 2017,6(7):1620-1630.
[2] Fujii S, Miura Y, Iwasa M, et al. Isolation of mesenchymal stromal/stem cells from cryopreserved umbilical cord blood cells[J]. J Clin Exp Hematop, 2017,57(1):1-8.
[3] Zhang H, Tao Y, Liu H, et al. Immunomodulatory function of whole human umbilical cord derived mesenchymal stem cells[J]. Mol Immunol, 2017,87:293-299.
[4] Kang SY, Park DE, Song WJ, et al. Immunologic regulatory effects of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in a murine ovalbumin asthma model[J]. Clin Exp Allergy, 2017,47(7):937-945.
[5] Li T, Zhang C, Ding Y, et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells promote proliferation and migration in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cells through activation of the ERK pathway[J]. Oncol Rep, 2015,34(3):1469-1477.
[6] Vulcano F, Milazzo L, Ciccarelli C, et al. Wharton′s jelly mesenchymal stromal cells have contrasting effects on proliferation and phenotype of cancer stem cells from different subtypes of lung cancer[J]. Exp Cell Res, 2016,345(2):190-198.
[7] Sousa BR, Parreira RC, Fonseca EA, et al. Human adult stem cells from diverse origins: an overview from multiparametric immunophenotyping to clinical applications[J]. Cytometry A, 2014,85(1):43-77.
[8] Liu A, Chen S, Cai S, et al. Wnt5a through noncanonical Wnt/JNK or Wnt/PKC signaling contributes to the differentiation of mesenchymal stem cells into type Ⅱ alveolar epithelial cells in vitro[J]. PLoS One, 2014,9(3):e90229.
[9] Yuan X, Zhang Q, Li Z, et al. Mesenchymal stem cells deliver and release conditionally replicative adenovirus depending on hepatic differentiation to eliminate hepatocellular carcinoma cells specifically[J]. Cancer Lett, 2016,381(1):85-95.
[10] Yuan X, Zhang Q, Li Z, et al. Mesenchymal stem cells deliver and release conditionally replicative adenovirus depending on hepatic differentiation to eliminate hepatocellular carcinoma cells specifically[J]. Cancer Lett, 2016,381(1):85-95.
[11] Gu J, Qian H, Shen L, et al. Gastric cancer exosomes trigger differentiation of umbilical cord derived mesenchymal stem cells to carcinoma-associated fibroblasts through TGF-beta/Smad pathway[J]. PLoS One, 2012,7(12):e52465.
[12] Kidd S, Spaeth E, Dembinski JL, et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging[J]. Stem Cells, 2009,27(10):2614-2623.
[13] Watson N, Divers R, Kedar R, et al. Discarded Wharton jelly of the human umbilical cord: a viable source for mesenchymal stromal cells[J]. Cytotherapy, 2015,17(1):18-24.
[14] McLean K, Gong Y, Choi Y, et al. Human ovarian carcinoma-associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production[J]. J Clin Invest, 2011,121(8):3206-3219.
[15] Chu Y, Tang H, Guo Y, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells promote cell proliferation and invasion of epithelial ovarian cancer[J]. Exp Cell Res, 2015,337(1):16-27.
[16] So KA, Min KJ, Hong JH, et al. Interleukin-6 expression by interactions between gynecologic cancer cells and human mesenchymal stem cells promotes epithelial-mesenchymal transition[J]. Int J Oncol, 2015,47(4):1451-1459.
[17] Bruno S, Collino F, Deregibus MC, et al. Microvesicles derived from human bone marrow mesenchymal stem cells inhibit tumor growth[J]. Stem Cells Dev, 2013,22(5):758-771.
[18] Waterman RS, Henkle SL, Betancourt AM. Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis[J]. PLoS One, 2012,7(9):e45590.