魏依蘭，曲杰，竇志杰，申曉平

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤，惡性程度高。GBM可發(fā)生于任何年齡，尤以45～65歲高發(fā)，30歲以下罕見(jiàn)，且男性多于女性。GBM病變部位主要位于額顳葉、頂葉和枕葉，小腦和基底節(jié)區(qū)少見(jiàn)，可同時(shí)累及多個(gè)腦葉。GBM分化程度差，常為密度較高的多形性細(xì)胞，亦有明顯的異型性，細(xì)胞核分裂活躍。GBM組織病理學(xué)特點(diǎn)為明顯的假柵欄樣壞死和腎小球/花蕾樣微血管增生[1～3]。GBM具有很高的浸潤(rùn)性，浸潤(rùn)生長(zhǎng)迅速為患者死亡的主要原因之一，其浸潤(rùn)生長(zhǎng)能力與腫瘤細(xì)胞遷移能力有關(guān)。目前，GBM標(biāo)準(zhǔn)的治療方法為最大范圍的手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療，但患者預(yù)后較差，且易復(fù)發(fā)[4]。絞股藍(lán)屬于葫蘆科落葉草質(zhì)藤本絞股藍(lán)屬植物，主要成分為絞股藍(lán)總皂苷(Gyp)，Gyp具有抗腫瘤、抗氧化、抗心肌缺血缺氧、抗腦缺氧、降血脂、護(hù)肝、增強(qiáng)免疫力等功效[5,6]。研究[5,7,8]表明，Gyp與其他中草藥配伍可用于治療肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等。研究[8]顯示，Gyp發(fā)揮抗腫瘤的作用是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但關(guān)于其抑制腫瘤細(xì)胞遷移功能方面的研究鮮有報(bào)道。本研究觀察了Gyp對(duì)GBM細(xì)胞株U87細(xì)胞形態(tài)、遷移能力的影響，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株、藥物、試劑、儀器U87細(xì)胞由承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。絞股藍(lán)干燥全草購(gòu)自安徽亳州中藥材市場(chǎng)，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物干燥全草。RPMI1640培養(yǎng)基干粉、FBS(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，IL-6抗體(PeproTech RD公司)，β-actin抗體(Sigma公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋公司)，HPD-700樹(shù)脂(滄州寶恩化工有限公司)。Primo R型低溫高速離心機(jī)(Heraeus公司)，CO2培養(yǎng)箱(Forma公司)，倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)，HFsafe-1500型生物安全柜(Heal force公司)，Transwell小皿(Millipore公司)，LS-75SI高壓消毒鍋(Yamato scientificwc公司)，HP-8453紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(惠普公司)，梅特勒-托利多AG245電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，JHBE-50S閃式提取器(河南省金鼐科技發(fā)展有限公司)。

1.2Gyp制備取絞股藍(lán)干草粉末20 g，加入10倍量的70%乙醇，用閃式提取器提取2次，第1次用時(shí)3 min，第2次用時(shí)1 min，合并提取液，抽濾，減壓，回收干燥。制備絞股藍(lán)樣品液：閃式提取法提取100 g絞股藍(lán)粗粉，合并提取液，減壓，回收乙醇至無(wú)醇味，加蒸餾水溶解，濾過(guò)，定容至200 mL(含Gyp 17.4 mg/mL)。100 mL錐形瓶中加入預(yù)處理后的HPD-700樹(shù)脂3 g，加入25 mL絞股藍(lán)樣品液，放入恒溫(25 ℃)搖床中振蕩24 h(140 r/min)，達(dá)到飽和吸附后濾出，收集吸附液。再用75%乙醇液洗脫，樹(shù)脂吸附容量為122.1 mg/g干樹(shù)脂[9]。配置10、5 mg/mL的Gyp溶液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 U87細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清及青、鏈霉素各100 U/mL)培養(yǎng)U87細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，利用0.25%胰蛋白酶消化傳代，收取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4U87細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察取6孔培養(yǎng)板接種U87細(xì)胞懸液，每孔1 mL，分別加入10、5 mg/mL的Gyp溶液各100 μL(分別計(jì)為A組和B組)，C組予等量PBS，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)板中細(xì)胞形態(tài)。不同濃度下的U87細(xì)胞培養(yǎng)均重復(fù)3次，留最典型結(jié)果作為最終數(shù)據(jù)。

1.5U87細(xì)胞遷移能力觀察①采用劃痕實(shí)驗(yàn)。在6孔培養(yǎng)板中接種U87細(xì)胞懸液，分別加入10、5 mg/mL的Gyp溶液100 μL(分別計(jì)為A組和B組)，C組予等量PBS，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)后劃痕，用PBS液沖洗1遍，洗去脫落細(xì)胞后，更換無(wú)胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。觀察和拍照記錄0、24 h顯微鏡下各組劃痕空白區(qū)的變化，計(jì)算細(xì)胞移動(dòng)后覆蓋劃痕區(qū)域的面積。②采用Transwell實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，以胰蛋白酶消化，RPMI1640培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，并行細(xì)胞計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液調(diào)整為每100 μL中5×104個(gè)U87細(xì)胞，再進(jìn)行鋪板。24孔培養(yǎng)板加入含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，每孔600 μL。在Transwell小室的上室分別加入100 μL含5×104個(gè)U87細(xì)胞的懸液，最后上室加入1%的BSA 10 μL，為保持上室內(nèi)的滲透壓，調(diào)整BSA最終濃度為0.1%。分別加入10、5 mg/mL的Gyp溶液100 μL(分別計(jì)為A組和B組)，C組予等量PBS，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)15 h。取出小室，90%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫溶液染色，置于倒置顯微鏡下觀察、拍照，隨機(jī)選擇4個(gè)×400倍視野行穿膜U87細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算4個(gè)視野中細(xì)胞數(shù)的平均值。重復(fù)3次。

1.6U87細(xì)胞IL-6蛋白檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87細(xì)胞，分別加入10、5 mg/mL的Gyp溶液100 μL(分別計(jì)為A組和B組)，C組予等量PBS，每組細(xì)胞數(shù)約5×106個(gè)。分別加入細(xì)胞裂解液300 μL中，冰上裂解30 min，然后用移液器將裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min離心4 min，收集上清液保存于-20 ℃下。BCA法測(cè)定蛋白濃度。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE電泳)每孔上樣蛋白45 μg，80 V電泳30 min，120 V電泳90 min，電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在搖床上用新鮮配制含5%脫脂奶粉的PBST液封閉2 h，加入IL-6抗體(1∶500)和抗β-actin抗體(1∶500)，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。取出PVDF膜，PBST液洗滌3次，每次15 min，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫封閉1 h，再用PBST液重復(fù)洗滌3次，10 min每次，最后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，X線(xiàn)片記錄結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較A組：細(xì)胞生長(zhǎng)慢、體積小、固縮現(xiàn)象非常明顯，細(xì)胞貼壁現(xiàn)象接近消失；B組：細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，體積縮小，胞質(zhì)固縮，部分細(xì)胞甚至破裂死亡，細(xì)胞生長(zhǎng)總體呈現(xiàn)分散懸浮現(xiàn)象，細(xì)胞貼壁現(xiàn)象減弱；C組：細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)則，輪廓清晰，形態(tài)飽滿(mǎn)，胞體透亮，貼壁生長(zhǎng)良好。

2.2各組細(xì)胞遷移能力比較A、B、C組細(xì)胞遷移覆蓋區(qū)域占原有劃痕區(qū)的54.8%、82.4%、98.6%，兩兩比較，P均<0.05。A、B、C組穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)分別占19.8%、58.9%、100%，兩兩比較，P均<0.05。

2.3各組IL-6蛋白水平比較A、B、C組IL-6蛋白水平分別為小量、中等量、大量，兩兩比較，P均<0.05。

3　討論

膠質(zhì)瘤是一種起源于神經(jīng)外胚層的膠質(zhì)細(xì)胞瘤，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)將中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)，其中GBM屬于Ⅳ級(jí)，惡性程度最高，患者中位生存期14～16個(gè)月，只有10%的患者確診后生存期超過(guò)36個(gè)月[10～12]。盡管目前治療GBM手術(shù)方式的進(jìn)步使膠質(zhì)瘤切除更精確，但由于其較強(qiáng)的侵襲能力，導(dǎo)致患者預(yù)后極差，超過(guò)90%患者在原有癌瘤周邊組織復(fù)發(fā)[13]。因此，降低GBM細(xì)胞的遷移能力對(duì)患者預(yù)后的改善顯得尤為重要。

Gyp是葫蘆科植物絞股藍(lán)提取出來(lái)的主要成分，其抗腫瘤作用備受關(guān)注。諸多研究[14]表明，Gyp對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW-480、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人舌癌細(xì)胞SCC4、人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13等遷移能力均有不同程度的抑制作用。而目前，關(guān)于Gyp對(duì)人GBM U87細(xì)胞遷移能力作用的影響鮮有報(bào)道。本研究顯示，Gyp可抑制U87細(xì)胞生長(zhǎng)及減弱細(xì)胞遷移能力，尤以10 mg/mL的Gyp效果更佳。

多種細(xì)胞因子表達(dá)水平異常與GBM的迅速浸潤(rùn)生長(zhǎng)有關(guān)[10,11]，其中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞離散和遷移的因子成為國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者研究的重點(diǎn)[15]。IL-6是由多種細(xì)胞分泌的一種多功能糖蛋白。近年大量實(shí)驗(yàn)證明，IL-6在眾多腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)與腫瘤的發(fā)病、診斷、治療及預(yù)后相關(guān)聯(lián)[16～19]。IL-6是GBM侵襲遷移的重要調(diào)節(jié)因子，在其遷移過(guò)程中起重要作用。IL-6可以通過(guò)影響蛋白酶分泌及細(xì)胞骨架重排兩方面機(jī)制，促進(jìn)GBM細(xì)胞的侵襲、遷移能力[16]。本研究顯示，隨著Gyp濃度的升高，IL-6蛋白表達(dá)水平越低，表示Gyp能降低細(xì)胞因子IL-6蛋白表達(dá)，從而抑制U87細(xì)胞生長(zhǎng)及減弱細(xì)胞遷移能力。

總之，Gyp可抑制U87細(xì)胞生長(zhǎng)及減弱細(xì)胞遷移能力，其機(jī)制可能與其可抑制U87細(xì)胞內(nèi)IL-6蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

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