顧 峰，周 巖，韋培培

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 201200)

微RNA(microRNAs,miRNA)是哺乳動物體內存在的一類非編碼RNA，在細胞內主要調節(jié)基因的表達[1]。國外研究證實miRNA表達異?？赡苷T導癌基因或抑癌基因表達，并誘導腫瘤細胞對化療藥物耐藥[2-3]。miRNA-134是廣泛存在于多種惡性腫瘤中的miRNA，研究證實miRNA-134具有抑制腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和誘導腫瘤細胞凋亡等一系列生物學功能[4-5]。RONG等[6]證實誘導miRNA-134高表達能夠增加人肺腺癌對化療藥物的敏感性，提示miRNA-134可能與化療耐藥有關。本研究采用miRNA基因芯片技術檢測乳腺癌化療敏感和化療耐藥患者外周血miRNA-134表達，并通過體外建立表柔比星、多西他賽耐藥的乳腺癌細胞系，觀察各細胞系間miRNA-134表達的差異，旨在探討外周血miRNA-134預測乳腺癌化療耐藥的作用機制，現(xiàn)將研究成果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年7月至2014年7月在本院行多西他賽+表柔比星+環(huán)磷酰胺方案(TEC方案)化療的初診乳腺癌患者98例，所有患者經(jīng)病理學確診后行TEC新輔助化療：靜脈滴注多西他賽75 mg/m2，第1天；靜脈滴注表柔比星50 mg/m2，第1天；靜脈滴注環(huán)磷酰胺500 mg/m2，第1天；21 d為1個周期，總計化療6個周期。6個化療周期結束后參考RECIST 1.1版實體瘤療效評價標準[7]對療效進行評價，完全緩解(CR)：所有目標病灶消失；部分緩解(PR)：基線病灶長徑總和縮小大于或等于30%；進展(PD)：基線病灶長徑總和增加大于或等于20%或出現(xiàn)新病灶；穩(wěn)定(SD)：基線病灶長徑總和有縮小但未達PR或有增加但未達PD。根據(jù)化療耐藥的評價標準[8]：將CR和PC患者列為化療敏感組(n=68)，SD和PD患者列為化療耐藥組(n=30)。化療結束后抽取患者外周肘靜脈血3 mL，靜置10～20 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱保存待檢。

1.2方法

1.2.1材料與試劑 人乳腺癌細胞系MCF-7為本院實驗室保存，正常傳代培養(yǎng)；多西他賽注射液購自海正輝瑞制藥有限公司，鹽酸表柔比星注射液購自奧地利依比威藥品有限公司，RNeasy MineElute clanup kit、miScript II RT Kit、miScript SYBR?Green PCR Kit均購自德國QIAGEN公司，RNA寡核苷酸miRNA mimics、miRNA抑制劑miRNA inhibitor均購自上海吉凱基因化學技術有限公司，轉染試劑LipofectamineTM2000、總RNA抽提試劑Trizol均購自美國Invitrogen公司，小鼠抗人Bax單克隆抗體、小鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、熒光標記的羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、二甲亞砜(DMSO)購自美國Gibco公司。

1.2.2儀器 VILBER凝膠成像儀及凝膠成像分析系統(tǒng)購自法國VILBER LOURMAT公司，流式細胞儀購自美國BD公司，紫外可見分光光度計和酶標儀均購自美國BioRad公司，PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司，倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，高速離心機購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2.3血清miRNA-134檢測 取約500 μL血清，參考RNeasy MineElute clanup kit說明書提取總RNA，檢測總RNA吸光度(optical delnsity,OD)值，以OD260/280值1.8～2.0表示樣品合格。將總RNA用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，以cDNA為模板、實時定量miRNA-134作為引物進行PCR反應，反應條件：引物濃度0.3 μmmol/L，96 ℃變性20 s，60 ℃退火45 s，總計35個循環(huán)。70～94 ℃繪制熔解曲線，分析PCR熔解曲線，每個樣品設3個平行孔，以U6作為內參照，計算miRNA-134的相對表達量(2-△△Ct)。引物委托上海生物科技工程有限公司合成，miRNA-134引物序列上游：5′-CCT AGC AGC ACA GAA A-3′，下游：5′-GAG CAG GCT GGA GAA-3′；內參U6上游：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CAT G-3′，下游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT G-3′。

1.2.4表柔比星耐藥細胞系的構建 參考QIN等[9]報道的方法，取對數(shù)生長期細胞，加入150 μL胰蛋白酶充分消化，1 500 r/min離心5 min收集細胞，加入不含血清的培養(yǎng)基重懸，調整細胞計數(shù)為1.0×109個/L；取10 mL細胞常規(guī)接種于培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；再向培養(yǎng)瓶中加入含10 mg/L表柔比星的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液；加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。待細胞重新恢復生長，繼續(xù)消化細胞，再換用含50 mg/L表柔比星的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，如此反復，分別加入含10、50、100、200、500 mg/L表柔比星的培養(yǎng)液反復誘導培養(yǎng)，最終獲得耐500 mg/L表柔比星的細胞株，將此細胞株在不含表柔比星的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5多西他賽耐藥細胞系的構建 參考QIN等[9]報道的方法，多西他賽耐藥細胞株誘導方法同表柔比星耐藥細胞系，只是向培養(yǎng)瓶中加入含10 mg/L多西他賽的培養(yǎng)液，最終獲得耐500 mg/L多西他賽的細胞株，將此細胞株在不含多西他賽的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6細胞增殖能力檢測 采用噻唑藍(MTT)比色法檢測各組細胞增殖能力：取對數(shù)生長期細胞，加入150 μL胰蛋白酶充分消化，1 500 r/min離心5 min收集細胞，加入不含血清的培養(yǎng)基重懸，調整細胞計數(shù)為1.0×109個/L；輕輕混勻細胞，于96孔板每孔中加入100 μL細胞懸液，再分別加入10、50、100、200、500 mg/L的表柔比星或多西他賽，每組濃度設置3個復孔，37 ℃、5% CO2下孵育。分別于孵育2、3、4、5、6、7 d后各取出1塊96孔板，棄去原培養(yǎng)液，加入新配置RPMI 1640培養(yǎng)液，再于每孔中加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，然后終止培養(yǎng)；再向每孔中加入100 μL DMSO，充分振蕩15 min，檢測各孔570 nm處的OD值。

1.2.7miRNA mimics、miRNA inhibitor轉染 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞(MCF-7組)和經(jīng)表柔比星、多西他賽處理過的MCF-7細胞(表柔比星組、多西他賽組)，分別加入150 μL胰蛋白酶充分消化，1 500 r/min離心5 min收集細胞，加入不含血清的培養(yǎng)基重懸，調整細胞計數(shù)為1.0×109個/L，將細胞接種于24孔板中，約2.0×105個/孔，再向每孔中含有LipofectamineTM2000、miRNA mimics或miRNA inhibitor的培養(yǎng)基，以僅加入LipofectamineTM2000試劑孔作為對照組，轉染36 h后棄去原培養(yǎng)液，重新更換新鮮含F(xiàn)BS完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.8細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的MCF-7細胞(MCF-7組)和經(jīng)表柔比星、多西他賽處理過的MCF-7細胞(表柔比星組、多西他賽組)，PBS沖洗3次，調整細胞計數(shù)為1.0×109個/L，向Falcon試管中加入200 μL細胞懸液，再分別加入Annexin Ⅴ和核酸染料，輕輕搖勻，室溫避光靜置10 min，再分別加入5 μL PI和0.5 μg SAv-FITC試劑，于1 h內上流式細胞儀進行檢測。

1.2.9細胞Bax、Caspase-3蛋白檢測 取200 μL細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，待培養(yǎng)瓶細胞融合度大于或等于80%時，將培養(yǎng)液吸出，PBS沖洗3次；再向每孔中加入100 μL 含1%PMSF的細胞裂解液，待細胞完全裂解后，15 000 r/min離心5 min，留取上清液。將上清液移至EP管中，加入等量上樣液，100 ℃煮沸5 min，使蛋白完全變性。采用Western blot檢測細胞Bax、Caspase-3蛋白表達：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，并轉移至PVDF膜上，100 mA、40 min電轉后將PVDF膜取出。5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入Bax單克隆抗體和Caspase-3單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，再分別加入羊抗兔IgG抗體(二抗)，室溫下振搖3 h，PBS沖洗3次。熒光圖像掃描及條帶灰度值分析，目的蛋白相對表對量為樣本條帶與GAPDH條帶灰度值之比。

2 結 果

2.1化療耐藥組與化療敏感組血清miRNA-134表達比較 化療耐藥組、化療敏感組miRNA-134表達水平分別為0.763±0.069、1.048±0.114，化療敏感組血清miRNA-134表達水平明顯高于化療耐藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2表柔比星、多西他賽耐藥細胞系形態(tài)學表征 加藥前MCF-7細胞呈長梭形，排列均勻；加入表柔比星24 h后，細胞胞體變圓，部分出現(xiàn)凸起，折光率變強；加入多西他賽24 h后，細胞核明顯腫脹，顆粒感增強；隨著撤藥時間的延長，表柔比星耐藥細胞和多西他賽耐藥細胞均恢復長梭形，見圖1、2。

2.33組細胞增殖能力比較 MCF-7組、表柔比星組、多西他賽組增殖能力均隨時間延長逐漸增強，第3、4、5、6、7天表柔比星組、多西他賽組細胞增殖能力明顯低于MCF-7組(P<0.05)，見表1。

A：加藥前；B：加藥24 h；C：不含表柔比星的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)第20天

圖1表柔比星加藥前后細胞形態(tài)變化(×100)

A：加藥前；B：加藥24 h；C：不含多西他賽的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)第20天

圖2 多西他賽加藥前后細胞形態(tài)變化(×100)

a：P<0.01，與MCF-7細胞組比較

表2 miRNA mimics等轉染后細胞miRNA-134表達

a：P<0.01，與同組轉染miRNA mimic細胞比較

表3 miRNA mimics等轉染后細胞凋亡率

a：P<0.01，與同組轉染miRNA-mimic細胞比較

表4 轉染后細胞Bax、Caspase-3蛋白表達

a：P<0.01，與同組轉染miRNA mimic細胞比較

2.4MCF-7細胞、表柔比星耐藥細胞、多西他賽耐藥細胞miRNA-134表達水平比較 MCF-7細胞、表柔比星耐藥細胞、多西他賽耐藥細胞miRNA-134表達水平分別為1.145±0.103、0.604±0.057、0.597±0.062。與MCF-7細胞系比較，表柔比星耐藥細胞系、多西他賽耐藥細胞系miRNA-134表達水平均明顯降低(P<0.05)。

2.5miRNA mimics、miRNA inhibitor轉染后各組細胞miRNA-134表達水平比較 各組轉染miRNA mimic細胞miRNA-134表達明顯高于未轉染細胞和轉染miRNA inhibitor細胞(P<0.05)；未轉染細胞與轉染miRNA inhibitor細胞miRNA-134表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.6miRNA mimics、miRNA inhibitor轉染后各組細胞凋亡水平比較 各組轉染miRNA mimics細胞凋亡率明顯高于未轉染細胞和轉染miRNA inhibitor細胞(P<0.05)，未轉染細胞與轉染miRNA inhibitor細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.7miRNA mimics、miRNA inhibitor轉染后各組細胞Bax、Caspase-3蛋白表達 各組轉染miRNA mimics細胞Bax、Caspase-3蛋白表達水平均明顯高于未轉染細胞和轉染miRNA inhibitor細胞(P<0.05)；未轉染細胞與轉染miRNA inhibitor細胞Bax、Caspase-3蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

3 討 論

WHO調查顯示，近10年來乳腺癌發(fā)病率呈明顯上升，且發(fā)病呈現(xiàn)年輕化趨勢[10]。新輔助化療是治療局部中晚期乳腺癌的標準方案，但是并非所有乳腺癌患者均能從新輔助化療中獲益。耐藥是導致化療失敗的主要原因。由于疾病的特異質和個體差異，目前依然有15%～30%的患者對化療不敏感[11]。因此，尋找準確、方便、快捷的化療耐藥預測指標，對提高乳腺癌患者的綜合療效具有重要意義。KATANODA等[12]報道稱miRNA能夠通過抑制細胞周期阻滯、促進損傷DNA修復、增強細胞侵襲能力等過程參與腫瘤化療耐藥。miRNA屬于獨立于細胞外的RNA，可以避免血液循環(huán)酶系的降解，其水平相對穩(wěn)定[13]，外周血miRNA也成為理想的生物標志物。

本研究顯示，化療敏感組血清miRNA-134表達水平明顯高于化療耐藥組(P<0.05)。ANDERSON等[14]報道稱miRNA-134能夠通過調控叉頭框蛋白M1、多藥耐藥相關蛋白1的表達，提高肺癌細胞對鉑類藥物的敏感性。本研究在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，加藥前細胞主要以梭形為主，化療藥物誘導初期，敏感的細胞逐漸凋亡，這部分細胞形態(tài)從梭形向圓形轉變；但是撤藥后細胞形態(tài)逐漸恢復，提示細胞形態(tài)學改變可能與乳腺癌細胞耐藥有關。另外，耐藥細胞增殖能力和miRNA-134表達明顯降低，說明miRNA-134可能與乳腺癌細胞增殖、分化有關。VIVEK等[15]研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-134能夠通過抑制細胞增殖達到抗癌作用。

本研究分別用miRNA mimic和miRNA inhibitor上調和下調乳腺癌細胞株miRNA-134表達，結果顯示未轉染細胞和轉染miRNA inhibitor細胞miRNA-134表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這可能是miRNA-134在乳腺癌細胞中本身即存在低表達，即使轉染miRNA inhibitor，miRNA-134下降的差異依然不明顯。此外，轉染miRNA mimics細胞凋亡率明顯升高，提示miRNA-134可以促進乳腺癌細胞發(fā)生凋亡。顧璽等[16]研究發(fā)現(xiàn)，用他莫昔芬誘導獲得敏感的子宮內膜癌細胞株miRNA-134表達明顯升高，而耐藥細胞株miRNA-134表達明顯降低；且miRNA-134高表達的細胞株更容易發(fā)生凋亡，說明miRNA-134的耐藥機制與細胞凋亡有關。

Bax蛋白是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，KUMAR等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Bax不僅能促進細胞自發(fā)凋亡，還能啟動細胞能多種凋亡信號途徑誘導細胞凋亡。Caspase-3蛋白是白細胞介素1β家族成員，在細胞凋亡中發(fā)揮關鍵作用[18-19]。竇越等[20]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌化療耐藥細胞株Caspase-3蛋白表達明顯降低，細胞凋亡受阻。GAO等[21]報道稱Bax是Caspase-3重要的上游調控基因，上調Bax表達能夠通過線粒體途徑促進細胞色素C的釋放，并促進下游靶基因Caspase-3的表達，起到誘導細胞凋亡的作用。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-134可能通過促進Bax、Caspase-3的表達，負調控乳腺癌化療耐藥，這也可能是乳腺癌化療耐藥逆轉的一條信號路徑。

綜上所述，miRNA-134可能通過促進Bax、Caspase-3的表達，增強乳腺癌細胞對化療的敏感性。

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