劉秀峰，許靜楊，袁文婭，梁 丹，時曉偉

(1.天津市農(nóng)作物研究所，天津300381;2.天津市植物保護研究所，天津300381)

由條形柄銹菌小麥?；?Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst)引起的小麥條銹病暴發(fā)性強、發(fā)生范圍廣，在我國曾發(fā)生多次大流行，危害嚴重［1］。利用分子手段研究小麥條銹菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)、遠距離傳播等有助于了解其流行動態(tài)。簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat，SSR)通常是由1～6 個核苷酸組成的串聯(lián)重復(fù)單元，廣泛分布在真核和原核生物基因組中，具有多態(tài)性高、重復(fù)性高、覆蓋面廣等優(yōu)點。在小麥條銹菌研究中，SSR標記已應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析和分子標記開發(fā)等方面［2-5］。目前小麥條銹菌研究所用的SSR標記數(shù)量有限，主要來自于cDNA文庫和表達序列標簽(Expressed sequence tag，EST)文庫［6-8］。最近報道了由小麥條銹菌基因組開發(fā)的SSR引物，即根據(jù)北美的PST130基因組序列開發(fā)的 25個 SSR引物［9］和中國的CY32基因組開發(fā)的20個多態(tài)性SSR引物［10］。由于小麥條銹菌表現(xiàn)出較低的遺傳差異，應(yīng)用SSR引物分析小麥條銹菌群體遺傳結(jié)構(gòu)時，往往獲得的遺傳差異信息過少［11］。可見，現(xiàn)有的小麥條銹菌SSR標記數(shù)量不能滿足其分子生物學(xué)研究的需求。為了提高SSR分辨小麥條銹菌遺傳差異的能力，有必要開發(fā)更多的SSR標記。RNA－seq是近年建立的基于深度測序的轉(zhuǎn)錄組分析新技術(shù)。本研究在通過RNA－seq技術(shù)對小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組測定基礎(chǔ)上，分析其轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)掘SSR位點，旨在為小麥條銹菌群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等開發(fā)新的SSR引物。

1 材料和方法

1.1 材料

小麥條銹菌為CY31、CY32、CY33小種和致病型V26單孢子堆分離物，用于繁殖的小麥品種為銘賢169。

1.2 方法

1.2.1 小麥條銹菌采集、RNA提取及測序 將小麥條銹菌分離物分別制成孢子懸浮液，用微型噴霧器分別噴霧接種于銘賢169第1片完全展開葉上。10℃下黑暗保濕 24 h后，放置于人工氣候室內(nèi)［17℃/14℃(日/夜)，每日光照16 h］。待葉片出現(xiàn)花斑后，剪去多余心葉，加上隔離罩。接種后16 d開始產(chǎn)生夏孢子時，立即分別收集夏孢子保存于液氮中。分別稱取20 mg小麥條銹菌夏孢子，采用Trizol法(Invitrogen，USA)提取小麥條銹菌總RNA，形成該時刻轉(zhuǎn)錄組的RNA池。提取過程中所用器具和耗材均經(jīng)過DEPC處理。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并用微量紫外分光光度計檢測其純度和濃度，然后利用Illumina HiSeqTM2000進行轉(zhuǎn)錄組測序，由諾禾致源公司執(zhí)行。

1.2.2 小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組SSR分析 對轉(zhuǎn)錄組測序得到的原始reads進行質(zhì)量控制，去除帶接頭的reads，去除片段內(nèi)未知堿基比例大于10%的reads，去除質(zhì)量值小于20的堿基數(shù)占整個reads 50%以上的低質(zhì)量 reads。然后，用 TopHat2［12］將過濾后的reads比對到小麥條銹菌基因組上，其錯配堿基數(shù)不高于2 bp。使用Trinity軟件［13］將未比對到小麥條銹菌基因組的reads進行組裝，參數(shù)為默認參數(shù)，最短contig長度設(shè)置為200 bp。比對和組裝以后得到小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)錄本，選取每個基因最長的轉(zhuǎn)錄本作為unigenes。將4個小麥條銹菌分離物轉(zhuǎn)錄組的unigenes合并，去除重復(fù)的unigenes，得到小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組高質(zhì)量的unigenes。

利用 MISA 軟件參照 http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/misa.html中步驟對小麥條銹菌unigenes進行SSR位點搜索，搜索的SSR基序重復(fù)單元長度為1～6個核苷酸，其限制條件為單核苷酸重復(fù)不低于10次，二核苷酸重復(fù)不低于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)不低于5次，2個SSR位點間的距離不大于100 bp則視為復(fù)合 SSR。用 Primer 3(http://primer3.sourcegorge.net)軟件對搜索到的SSR位點設(shè)計引物。設(shè)計原則為引物序列中不含SSR、獲得的引物序列可以比對到unigenes序列、去除可比對到不同unigenes序列的引物、引物的5'端允許有3個堿基的錯配、退火溫度在55～64℃、引物長度在18～27 bp、G+C含量在40%～60%。同時注意盡量避免出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)。

隨機合成100對符合篩選條件的引物，每對引物中一條引物的5'端連接FAM熒光素，內(nèi)標為GS500LIZ。以小麥條銹菌 CY31、CY32、CY33基因組DNA為模板進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730XL分析后進行引物篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥條銹菌RNA－seq數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

小麥條銹菌CY31、CY32、CY33小種和致病型V26的 RNA 質(zhì)量濃度范圍在 165～206 ng/μL，18S、28S條帶清晰(圖1)。4個樣品共產(chǎn)生396 711 824個原始reads，原始數(shù)據(jù)每種堿基含量約為25%，說明原始數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。經(jīng)過質(zhì)量控制后得到382 125 418個reads。將過濾后reads與小麥條銹菌基因組(PST－78，GenBank:AJIL00000000.1)比對，結(jié)果顯示，4個樣品數(shù)據(jù)的 71.15%～74.21%比對到了參考基因組上，其中單個定位的測序序列(Uniquely mapped reads)占總體(Clean reads)的百分比在70.14%～73.13%，多個定位的測序序列(Multiple mapped reads)占總體的百分比在 0.99%～1.16%。這些結(jié)果說明本研究所使用的測序數(shù)據(jù)真實可靠，能夠保證分析結(jié)果的正確性。

圖1 小麥條銹菌RNA

2.2 小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組的SSR分布

4個小麥條銹菌分離物轉(zhuǎn)錄組57.32 Gb的clean reads組裝unigenes后，合并、去除重復(fù)的unigenes得到20 802條高質(zhì)量unigenes，總堿基數(shù)為27 893 297 bp，平均每條unigene長約1 340 bp。根據(jù)1.2.2中所述條件進行SSR篩選，在2 941條unigenes中發(fā)現(xiàn)6 083個SSR位點。SSR發(fā)生頻率(含有SSR的unigenes數(shù)目占總unigenes數(shù)目的比例)為14.13%，平均每9.84 kb出現(xiàn)1個SSR 位點，其中包含單個SSR位點的unigenes有1 615條，占含有SSR位點 unigenes總條數(shù)的 54.9%。1 326條unigenes含有1個以上SSR位點，其中絕大多數(shù)含有2～4個 SSR位點，6條 unigenes含有12個 SSR位點，含有14、15、20個SSR位點的unigenes各1條。

小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型豐富，從單核苷酸重復(fù)到六核苷酸重復(fù)均有出現(xiàn)。6種重復(fù)核苷酸類型組成的SSR數(shù)量存在較大差異，以單核苷酸重復(fù)(2 575個)和三核苷酸重復(fù)(2 427個)所占比例較高，分別占SSR總數(shù)的42.33%和39.90%，分布頻率(SSR數(shù)量/總unigenes數(shù)量)分別為12.38%和11.67%?？傮w上，二、四、五、六核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)量依次遞減，但六核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)量大于五核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)量。11個五核苷酸重復(fù)類型的SSR數(shù)量均為1個(表1)。

小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組中含有豐富的重復(fù)基序，不同重復(fù)類型的小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組SSR中有多種基序。單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)SSR出現(xiàn)的基序種類分別為4、10、56、44、11、19 種，共有 144 種。在本研究篩選的SSR中，單核苷酸重復(fù)的優(yōu)勢基序為T，占單核苷酸重復(fù)的60.00%，G重復(fù)類型所占比例最少。在三核苷酸重復(fù)基序中，優(yōu)勢基序有AAC、ATC、CAT，分別為301、140、138個，AAC重復(fù)類型的SSR所占比例最高，而TTG類型的SSR數(shù)量最少，僅有1個。五核苷酸和六核苷酸重復(fù)的SSR數(shù)量較少，二者加起來僅占 SSR總數(shù)的 0.53%，分布頻率分別為0.05%和 0.10%(表 1)。

表1 小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型分布特征

2.3 小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)次數(shù)和基序長度

從重復(fù)次數(shù)上看，小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)類型的重復(fù)次數(shù)存在明顯差異。除單核苷酸外，5、6次重復(fù)的SSR最多，分別為1 488個和1 016個，兩者之和占總SSR個數(shù)的41.16%，7次重復(fù)的SSR有452個，占 7.43%，≥12次重復(fù)的 SSR個數(shù)為63個，所占比例僅為1.04%。表2中數(shù)據(jù)表明，隨著重復(fù)次數(shù)的增加各重復(fù)類型SSR數(shù)量呈現(xiàn)出遞減的趨勢。二核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)數(shù)為6～8次，三核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)數(shù)為5～8次，四核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)數(shù)為5～6次，五、六核苷酸重復(fù)的主要重復(fù)數(shù)為5次，說明隨著核苷酸重復(fù)數(shù)的增加，同一重復(fù)類型的SSR總數(shù)也呈現(xiàn)變小的趨勢?？梢姡蛑貜?fù)次數(shù)的變異引起位點長度的變異是產(chǎn)生SSR多態(tài)性的主要原因。另外，分析數(shù)據(jù)表明，基序連續(xù)重復(fù)數(shù)最多的為三核苷酸 TAC，達 32次(unigene為PSTG－07600)，T基序連續(xù)重復(fù)可達31次(unigene為PSTG－16488)。六核苷酸基序的連續(xù)重復(fù)次數(shù)整體上大于五核苷酸，其中AAGGAG基序連續(xù)重復(fù)次數(shù)為15次(unigene為 PSTG－04191)，AAAACA(unigene為 PSTG－16928)和 CTCAAT(unigene為PSTG－14376)基序連續(xù)重復(fù)次數(shù)均為11次，而五核苷酸基序的連續(xù)重復(fù)次數(shù)最多為6次。

表2 小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組SSR各重復(fù)基序長度的重復(fù)次數(shù)分布特征 個

統(tǒng)計SSR長度分布發(fā)現(xiàn)，小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組SSR基序長度分布在10～435 bp，其中復(fù)合SSR的長度在22～435 bp，主要集中在 80～199 bp，共有934個，占總SSR個數(shù)的15.35%。除去復(fù)合 SSR，總體上小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組SSR基序長度分布在10～90 bp，12～20 bp基序長度的SSR數(shù)量最多(3 238個)，占總SSR個數(shù)的53.22%，大部分基序長度集中在 15 bp，10～11 bp的 SSR 有 1 390個，占 22.85%。大于20 bp的SSR數(shù)量較少，有521個，占8.6%(圖2)。

圖2 小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組SSR基序長度分布

2.4 小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組SSR引物篩選

選取 100對熒光引物對小麥條銹菌 CY31、CY32、CY33基因組 DNA進行 PCR擴增，ABI 3730XL檢測結(jié)果顯示，共有87對引物產(chǎn)生清晰、穩(wěn)定的峰，即均有擴增產(chǎn)物。其中，75對引物擴增產(chǎn)物顯示1個峰，12對引物顯示2～4個峰，即2～4個等位基因。

3 結(jié)論與討論

SSR標記傳統(tǒng)開發(fā)方法是構(gòu)建cDNA文庫篩選，高通量測序技術(shù)為大規(guī)模篩選SSR標記提供了新的工具，例如從小麥條銹菌PST130基因組中發(fā)現(xiàn)1 889個SSR位點［9］。轉(zhuǎn)錄組是在特定的發(fā)育階段和不同的生理條件下所有轉(zhuǎn)錄的RNA集合。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得含有微衛(wèi)星的序列，并用其進行遺傳多樣性研究在一些物種上已有報道。本研究利用小麥條銹菌夏孢子形成時的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)SSR標記位點，獲得的SSR位點中除單核苷酸外，以三核苷酸重復(fù)基序為主要類型，與由小麥條銹菌基因組發(fā)掘的SSR位點中的主導(dǎo)類型為二、三核苷酸重復(fù)基序的結(jié)果一致［10］。而且，目前報道的小麥條銹菌SSR中的一部分與本研究發(fā)掘的SSR位點信息完全相同或相近。例如，Zhan等［10］報道的WSR7、WSR23、WSR90與本研究中相應(yīng)SSR的重復(fù)基序、重復(fù)次數(shù)以及設(shè)計的引物對完全一致，WSR79、WSR95、WSR62、WSR85 等與本研究中相應(yīng)SSR重復(fù)基序一致，與設(shè)計引物對的其中1條一致，說明利用小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組開發(fā)SSR引物是可行的。隨機合成的100對引物中，有87對可以擴增出產(chǎn)物，說明設(shè)計的引物有效，在后續(xù)工作中需要加強開發(fā)在小麥條銹菌群體中具有多態(tài)性的引物。本研究設(shè)計的引物合成時進行了熒光修飾，該方法雖然費用比瓊脂糖凝膠電泳檢測略高，但篩選效率高，工作量相對較小，適合大規(guī)模篩選SSR引物。利用轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR位點可能與功能基因相關(guān)，由小麥條銹菌轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR中的一部分與由基因組發(fā)掘的SSR具有一致性，可能與該位點基因在小麥條銹菌中具有保守性有關(guān)。最近報道了小麥條銹菌中一個高度保守的效應(yīng)子Puccinia NPR1 interactor(PNPi)，推測PNPi的高度保守性與小麥條銹菌在進化競爭中取得優(yōu)勢有關(guān)，改變PNPi蛋白結(jié)構(gòu)可能影響小麥條銹菌的寄生適合度［14］。

通過分析小麥條銹菌夏孢子形成時轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，配合熒光標記，可以批量篩選SSR引物，有望發(fā)現(xiàn)小麥條銹菌產(chǎn)孢過程中表達基因的等位位點變異，設(shè)計出更多的具多態(tài)性的SSR引物，還可能發(fā)現(xiàn)與小麥條銹菌產(chǎn)孢量密切相關(guān)的基因。目前，筆者正在利用多個小麥條銹菌分離物篩選本研究設(shè)計的SSR引物，篩選出的多態(tài)性引物加上已經(jīng)報道的SSR引物可以應(yīng)用在大范圍的小麥條銹菌基因型和群體動態(tài)研究中。

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