宋金亮，朱 磊，賈聖風，武向斌，張凱歌，孫守如

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河南鄭州450002)

西葫蘆(Cucurbita pepo L.)，別名美洲南瓜，為葫蘆科南瓜屬1年生蔓生草本植物，具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能，且產(chǎn)量高、耐儲運。西葫蘆作為我國普遍栽培的一種瓜類蔬菜，種植面積在逐年增加，保護地栽培面積僅次于黃瓜，但其育種研究相對于其他葫蘆科瓜類較為滯后，新品種更新較慢。常規(guī)育種在一定程度上限制了雜交一代的選育速度，而離體雌核培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體通過自然或人工加倍可快速獲得雙單倍體純系，以便配置雜交組合，進而加快育種進程［1-2］。近年來，關(guān)于西葫蘆未受精胚珠或未授粉子房離體培養(yǎng)的報道較多，離體雌核培養(yǎng)技術(shù)也取得了一定的進展［3-6］。盡管多數(shù)研究經(jīng)胚狀體或愈傷組織途徑獲得了胚囊植株，但再生植株誘導(dǎo)率低，倍性鑒定體系不完善的問題依然存在［7］。利用莖尖與腋芽離體培養(yǎng)可以對稀缺材料進行長期保存與快速繁殖，同時避免優(yōu)良性狀的分離與丟失［8］。莖尖快繁技術(shù)在馬鈴薯［9］、山藥［10］、草莓［11］等作物的育種中應(yīng)用廣泛。開展西葫蘆離體雌核再生植株快繁技術(shù)的研究對保持植株優(yōu)良性狀、胚囊植株倍性育種及進行后代遺傳分析都有重要意義［12］。因此，以西葫蘆胚囊植株莖尖為外植體，系統(tǒng)研究了不同種類及其不同質(zhì)量濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對再生胚囊植株莖尖增殖及再生腋芽生根的影響，比較了莖尖、根尖以及卷須3種部位的組織利用染色體計數(shù)法進行倍性鑒定的差異，并對西葫蘆氣孔密度及保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)與倍性的關(guān)系進行探索，旨在建立一種高效可行的西葫蘆胚囊植株莖尖快速繁殖方法，并為西葫蘆倍性鑒定的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與培養(yǎng)條件

以西葫蘆品種ZY10號為試材，該品種生長力旺盛，產(chǎn)量高，且具有較強的低溫弱光耐受性［13］。8月初穴盤育苗，待幼苗長到三葉一心(苗齡15 d左右)定植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科教園區(qū)溫室內(nèi)。于花期即從第三雌花開始采樣，開花前1 d 18:00左右采摘未授粉子房，以 MS+0.06 mg/L TDZ+0.5 mg/L 6－BA為培養(yǎng)基進行胚狀體誘導(dǎo)，然后將誘導(dǎo)胚狀體轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)并獲得再生胚囊植株。試驗均以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)試驗要求添加植物生長調(diào)節(jié)劑，瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為2 500～3 000 lx，光照周期為 14 h/10 h。

1.2 試驗方法

1.2.1 增殖培養(yǎng) 將再生胚囊植株莖尖接種到增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置添加不同質(zhì)量濃度的 6－BA(0.25、0.50、1.00 mg/L)和NAA(0.50 mg/L)，篩選出莖尖增殖的最適培養(yǎng)基。每處理接種16個外植體，重復(fù)3次，接種30 d后統(tǒng)計芽苗增殖情況。增殖倍數(shù)=增殖芽總數(shù)/接種外植體數(shù)，增殖率=增殖的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.2 生根培養(yǎng) 當腋芽長到2～3 cm時，由基部切斷后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。生根培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置添加不同質(zhì)量濃度的 NAA(0.1、0.25、0.50 mg/L)和 IBA(0.1、0.5 mg/L)，篩選出最適生根培養(yǎng)基。每處理接種10個再生腋芽，重復(fù)3次，10 d后開始記錄生根情況，接種20 d后統(tǒng)計生根率。生根率=生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.2.3 倍性鑒定方法

1.2.3.1 染色體計數(shù)法 以西葫蘆莖尖(植株生長點)、根尖及卷須為材料，參考王艦等［14］的方法并稍作改進。具體步驟如下:9:00左右，分別取莖尖、根尖、卷須1～2 cm，放入0.1%秋水仙素水溶液預(yù)處理3 h，用改良的卡諾氏固定液固定24 h，將固定后的材料經(jīng)95%乙醇和85%乙醇各浸泡30 min，用蒸餾水漂洗3～4次，每次2 min，用60℃ 1 mol/L HCl溶液解離10 min，解離后用蒸餾水沖洗3 min并用濾紙吸干，用改良苯酚品紅染色液染色20 min，切取分生區(qū)部分，用鑷子將材料搗碎，滴1滴45%的冰醋酸，蓋上蓋玻片，用橡皮輕輕敲擊使根尖分散，在400倍顯微鏡下進行染色體數(shù)目的觀察并計數(shù)。

1.2.3.2 氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法 參照張菊平等［15］的方法并稍作改進。具體步驟如下:用刀片輕輕在葉下表皮的葉脈上劃一個裂口，用鑷子從裂縫處撕取下表皮置于載玻片上，并將其展平，滴2滴1%碘－碘化鉀(用蒸餾水稀釋后效果更好)，染色3 min，在100倍顯微鏡下，以視野內(nèi)的面積(1.77 mm2)進行觀察比較，每張葉片隨機觀察統(tǒng)計30個視野內(nèi)的氣孔數(shù)及葉綠體數(shù)，拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)整理，運用SPSS 16.0對所得數(shù)據(jù)進行t檢驗和χ2適合性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對西葫蘆莖尖增殖的影響

將西葫蘆胚囊植株莖尖接種到增殖培養(yǎng)基上，試驗結(jié)果顯示(表1、圖1)，培養(yǎng)14 d后可見萌發(fā)的腋芽，28 d后形成叢生不定芽。在基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基上，50%的苗芽能夠誘導(dǎo)形成腋芽，芽苗增殖倍數(shù)為1.50。當添加0.50 mg/L的NAA時，莖尖不能得到有效的增殖，增殖倍數(shù)為0，芽苗基部形成大的愈傷塊，植株生長勢弱，其中有4株死亡。培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的6－BA對腋芽的增殖率影響顯著，當6－BA質(zhì)量濃度為0.50 mg/L 時，75.0%的芽苗能增殖出腋芽，最多增殖出3個，平均每個芽苗可生成2.37個，其次是6－BA 為 0.25 mg/L 時，增值倍數(shù)為 1.88，當 6－BA 質(zhì)量濃度為1.00 mg/L 時，增殖倍數(shù)較低，僅為 1.63，但高于基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基處理。結(jié)合增殖倍數(shù)及生長勢，篩選出西葫蘆胚囊植株莖尖增殖的最適培養(yǎng)基為MS+0.50 mg/L 6－BA。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度組合對西葫蘆胚囊植株莖尖增殖的影響

圖1 西葫蘆再生植株擴繁

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)量濃度對西葫蘆增殖腋芽生根的影響

將誘導(dǎo)增殖出的健壯不定腋芽接種到生根培養(yǎng)基上，結(jié)果表明(表2、圖1)，不同種類及質(zhì)量濃度植物生長調(diào)節(jié)劑均能誘導(dǎo)西葫蘆腋芽生根，使用NAA和IBA處理影響差異顯著。培養(yǎng)基中添加0.50 mg/L的IBA時，基部愈傷化嚴重，生根率最低，僅為13.3%。在本試驗中，NAA的誘導(dǎo)效果普遍較IBA好，其中以0.10 mg/L NAA處理的生根率最高，達 83.3%，其次為 0.25 mg/L NAA，生根率為50.0%。提高NAA質(zhì)量濃度，生根率逐漸下降，生根變粗且根毛減少，基部愈傷增多，繼代培養(yǎng)后移栽存活率降低，與前人在西瓜上報道的結(jié)果一致［16-17］。因此，MS+0.10 mg/L NAA 為西葫蘆再生腋芽最適宜的生根培養(yǎng)基。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對西葫蘆增殖腋芽生根的影響

2.3 西葫蘆不同組織進行染色體鑒定的差異

由圖2、表3可知，在400倍顯微鏡下3種組織材料均可觀察到染色體。用莖尖作為鑒定材料時，細胞密度大，但體積小，細胞內(nèi)染色體重疊，嚴重影響倍性鑒定。根尖作為鑒定材料時，細胞密度大，體積也較大，大部分細胞重疊，細胞內(nèi)染色體稍有重疊，染色體較清晰，基本可進行倍性鑒定。而卷須作為鑒定材料時，細胞大，分散，基本無重疊，細胞內(nèi)染色體清晰。由此可知，西葫蘆卷須可作為根尖染色體計數(shù)的替代材料。

圖2 西葫蘆再生植株倍性鑒定

表3 西葫蘆不同組織對染色體鑒定的影響

2.4 西葫蘆氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)與倍性的相關(guān)性

對不同倍性西葫蘆葉片氣孔密度及保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)進行比較可知(圖2、圖3)，氣孔數(shù)隨倍性的增加而減少，葉綠體數(shù)隨倍性的增加而增加。單倍體氣孔數(shù)平均值為112個，而二倍體的氣孔數(shù)平均值為55個，差異極顯著(P＜0.01)。單倍體和二倍體的葉綠體數(shù)平均分別為4.79個和8.79個，差異顯著(P＜0.05)。試驗結(jié)果表明，二倍體與單倍體葉綠體數(shù)平均值的比值約為1.84∶1，基本接近于染色體數(shù)理論值之比2∶1;而二倍體與單倍體的氣孔數(shù)比值約為1∶2.22，單倍體的氣孔數(shù)約為二倍體的2倍。單、二倍體西葫蘆的氣孔數(shù)和葉綠體數(shù)均呈顯著差異，因此可作為倍性鑒定的有效依據(jù)。

2.5 不同倍性西葫蘆氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)分布頻率

由不同倍性西葫蘆氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)分段結(jié)果(表4)可知，單倍體和二倍體西葫蘆的葉綠體數(shù)變異系數(shù)均較大，分別達到21.2%和15.8%。單倍體氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)為3～8個，葉綠體數(shù)為4個的最多，占42.68%，4～5個的占68.29%，且葉綠體數(shù)≤6個的占95.73%;二倍體為6～13個，葉綠體數(shù)為8個的最多，占 34.75%，9～12 個的占51.83%。因此，以葉綠體數(shù)為7個作為分界指標來判定倍性，葉綠體數(shù)小于7個為單倍體，大于或等于7個為二倍體，單、二倍體判定的準確率分別達95.73%和94.51%。

圖3 西葫蘆氣孔數(shù)及保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)與倍性的關(guān)系

表4 西葫蘆不同倍性植株氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)的分段頻率 %

3 結(jié)論與討論

研究表明，細胞分裂素有利于芽的增殖，其中低質(zhì)量濃度6－BA的增殖效果優(yōu)于KT和ZT［18］。王家珍等［19］發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量濃度6－BA使外植體葉片卷曲甚至畸形，而低質(zhì)量濃度的6－BA能促進外植體生長，并且葉片生長正常。宗娟等［20］的研究中，當6－BA質(zhì)量濃度升高到1.20 mg/L時，新稍葉片卷曲畸形，且出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在本試驗中，MS+0.50 mg/L 6－BA對西葫蘆芽苗的腋芽誘導(dǎo)增殖率最高，達75.0%，當6－BA 質(zhì)量濃度升高到1.00 mg/L 時，不利于腋芽的分化，分化的不定芽簇生，多畸形，不能用于擴繁操作，與前人研究結(jié)果相符。另外，本試驗在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基上有50.0%的莖尖增殖出腋芽，增殖倍數(shù)為 1.50，王建書等［8］研究認為，西葫蘆莖尖在基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基上雖能進一步生根，但發(fā)育緩慢，不能促進基部腋芽的發(fā)生，這可能是由于外植體的獲取途徑不同造成的，本試驗所選用的莖尖來自受植物生長調(diào)節(jié)劑影響的再生胚囊植株，而王建書則直接從實生苗上截取莖尖，前期培養(yǎng)沒受到植物生長調(diào)節(jié)劑的影響。

宗娟等［20］認為，NAA具有較好的根誘導(dǎo)效應(yīng)。趙曉菲［21］也指出，培養(yǎng)基中NAA 質(zhì)量濃度為0.05 mg/L或0.10 mg/L時胚狀體不定根發(fā)生率顯著高于不添加NAA的培養(yǎng)基，而質(zhì)量濃度超過0.10 mg/L時平均生根時間明顯延長。在本試驗中發(fā)現(xiàn)，NAA質(zhì)量濃度為 0.10 mg/L 時，生根率最高，達83.3%，在其他處理的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根率均較低。降低無機鹽質(zhì)量濃度配合一定的植物生長調(diào)節(jié)劑常常能解決再生苗生根難的問題［22］。例如，櫻桃在MS培養(yǎng)基上不能生根，而在1/2MS培養(yǎng)基上可形成根［23］。劉獨臣等［16］在對西瓜莖尖離體再生體系的構(gòu)建過程中發(fā)現(xiàn)，添加1/2MS+0.10 mg/L NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率達100%。因此，在以后的試驗中，將對不同質(zhì)量濃度無機鹽對腋芽的生根效果進行比較。

染色體倍性化在遺傳育種、作物品種改良及優(yōu)良性狀利用上發(fā)揮著越來越重要的作用，倍性鑒定是倍性育種及其應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)。在眾多鑒定方法中，染色體制片法是細胞倍性鑒定最直接可靠的方法。因其計數(shù)準確，不需要復(fù)雜的儀器，也是目前應(yīng)用最多的鑒定方法。常規(guī)染色體制片一般采用莖尖、根尖、卷須、愈傷組織等材料［24］。郭啟高等［25］在西瓜組織培養(yǎng)早期，利用不定芽葉尖染色體計數(shù)法檢出植株倍性。王艦等［14］研究了馬鈴薯匍匐莖莖尖、塊莖莖尖和試管苗根尖不同組織的差異，發(fā)現(xiàn)塊莖的莖尖和匍匐莖的莖尖作為染色體數(shù)目鑒定材料效果都比較好。陳勁楓等［26］指出，對于卷須類種質(zhì)資源，尤其在種子缺乏、材料極其珍貴的情況下，卷須是理想的染色體研究材料。本試驗通過對西葫蘆莖尖、根尖和卷須作為鑒定材料的效果進行對比，發(fā)現(xiàn)根尖和卷須均可區(qū)分不同倍性材料，卷須與根尖相比，取卷須對珍貴的單倍體材料無損傷，可以作為西葫蘆根尖染色體倍性鑒定的替代材料。

雖然染色體計數(shù)法準確性高，但此方法耗時而且需要熟練的細胞學(xué)操作技術(shù)［27］，而西葫蘆染色體小，染色體數(shù)目多，細胞密度大，在制片過程中細胞和染色體均易造成重疊，大批量的鑒定十分困難。葉片氣孔保衛(wèi)細胞鑒定法，因其操作簡單、經(jīng)濟實惠和適合大容量樣本的倍性鑒定等特點，在葫蘆科作物倍性鑒定中受到廣泛重視和應(yīng)用［28-29］。如王康等［30］研究發(fā)現(xiàn)，四倍體和二倍體相比在氣孔大小、密度和葉綠體數(shù)目方面存在顯著差異，可在早期利用氣孔特征快速鑒定、排除二倍體植株。閔子揚等［29］認為，南瓜單倍體再生植株的保衛(wèi)細胞平均葉綠體數(shù)目為4.28個，二倍體植株平均葉綠體數(shù)為8.37個。施先鋒等［31］提出，西瓜二倍體氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)為8～14個，四倍體氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)為15～21個，即二倍體的葉綠體數(shù)＜15個，四倍體的葉綠體數(shù)≥15個，初步將葉綠體數(shù)15個作為鑒定西瓜二倍體和四倍體的分界指標。本研究結(jié)果表明，氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)為7個可作為西葫蘆鑒定單二倍體的界限，葉綠體數(shù)＜7個為單倍體，準確率達95.73%，葉綠體數(shù)≥7個為二倍體，準確率達94.51%。本結(jié)論可能受品種及材料來源的影響，對于其他品種來源的材料是否適用還需要進一步探究。

試驗過程中發(fā)現(xiàn)，胚囊再生植株雖然可以實現(xiàn)莖尖擴繁，但培養(yǎng)一段時間的莖尖普遍存在“花打頂”，這種現(xiàn)象嚴重影響了植株的生長，以后將在培養(yǎng)基中添加GA對“花打頂”現(xiàn)象進行抑制，進一步完善胚囊植株莖尖培養(yǎng)快繁技術(shù)。

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