朱 昀，李朝煒，劉嗣凡，劉 穎，魏景芳

(河北科技大學(xué)，河北石家莊050018)

熱不對稱交錯PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR，Tail－PCR)是一種分離已知DNA序列旁側(cè)未知序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法通過不同特異引物與簡并引物的組合，進行3輪PCR擴增，采取高溫特異性擴增與低溫隨機擴增相間進行的特殊熱循環(huán)程序，達到特異產(chǎn)物擴增的同時抑制由隨機引物產(chǎn)生的非特異擴增的目的［1］。該方法簡單易行，能夠在較短的時間內(nèi)獲得目標片段，產(chǎn)物特異性高，結(jié)果較為穩(wěn)定［2］。目前，采用此方法已成功對大豆、棉花、小麥、油菜、紅豆杉、天山雪蓮、擬南芥等植物已知序列的側(cè)翼序列進行了分析［3-8］。

為了對已獲得的大量轉(zhuǎn)基因旱稻純合體株系進行插入位點旁側(cè)序列分析，本研究以轉(zhuǎn)基因旱稻為材料，參考前人成功經(jīng)驗，結(jié)合河北科技大學(xué)生物技術(shù)實驗室的實際情況，對Tail－PCR方法進行探索改進和優(yōu)化，旨在為轉(zhuǎn)基因旱稻的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)基因T3代旱稻由河北科技大學(xué)生物技術(shù)實驗室通過農(nóng)桿菌侵染法獲得［9-11］，通過Southern blot分析確定外源基因為單拷貝［12］。侵染所用質(zhì)粒為改造的pCAMBIA3301。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 采用改良的 CTAB 法［13］對旱稻基因組進行提取，略加改動。剪取轉(zhuǎn)基因植株葉片0.2 g，放于2 mL裝有小鋼珠的離心管中，迅速置于液氮中冷凍2 min，在研磨機上進行研磨;葉片研成粉末后，向每個離心管中加入600 μL提取液［CTAB 3%(m/V)，NaCl 1.4 mol/L，EDTA(pH 值 8.0)20 mmol/L，Tris－HCl(pH 值 8.0)100 mmol/L，β－巰基乙醇0.2%(m/V)］，混勻后放于65℃水浴鍋中水浴30 min，期間輕柔搖晃數(shù)次;將小鋼珠從離心管中取出，12 000 r/min離心15 min;取上清于新的1.5 mL的離心管中，加等體積酚/氯仿/異戊醇，充分混勻;12 000 r/min離心15 min，吸取上清，加等體積氯仿/異戊醇，充分混勻;12 000 r/min離心10 min，吸取上清，加入－20℃提前預(yù)冷的異丙醇，使之與上清體積相等，輕柔地混合均勻，－20℃冰箱放置20 min;12 000 r/min離心 5 min，棄上清，75% 的乙醇洗滌1次，無水乙醇洗1次，室溫晾干;待管壁無殘留液體、DNA呈半透明狀時，加50 μL TE溶解，－20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計 Tail－PCR的右臂第1條特異引物設(shè)計在pCAMBIA3301右邊界以內(nèi)，依次向外設(shè)計3條特異引物(R1、R2、R3)，每條引物間隔50～150 bp。左臂的第 1條特異引物設(shè)計在 pCAMBIA3301左邊界以內(nèi)，依次向外設(shè)計3條特異引物(L1、L2、L3)，每條引物間隔 50～150 bp。左右臂 6條特異引物退火溫度在60～65℃，G+C含量在40%～60%。簡并引物采用 Liu等［14］引物，共 5條(LAD1、LAD2、LAD3、LAD4、AC)。各引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 Tail－PCR擴增 將特異引物與簡并引物配對進行3輪擴增。第1輪左臂側(cè)翼序列分析的引物組合方式分別為 L1+LAD1、L1+LAD2、L1+LAD3、L1+LAD4，右臂側(cè)翼序列分析的引物組合方式為R1+LAD1、R1+LAD2、R1+LAD3、R1+LAD4。第2 輪左臂引物組合方式為L2+AC，右臂引物組合方式為R2+AC。第3輪左臂引物組合方式為L3+AC，右臂引物組合方式為R3+AC。反應(yīng)的第1輪產(chǎn)物稀釋40倍作為第2輪模板使用，第2輪產(chǎn)物稀釋10倍作為第3輪PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系見表2，PCR反應(yīng)程序見表3。

表2 Tail－PCR反應(yīng)體系

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測及分析 將Tail－PCR第2輪與第3輪反應(yīng)產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，由于3輪擴增的特異引物為巢式引物，所以第3輪擴增產(chǎn)物略小于第2輪。挑選在第2輪和第3輪擴增中大小關(guān)系適當(dāng)并且大于500 bp的條帶回收測序。將測序結(jié)果在NCBI上比對，分析插入位點旁側(cè)序列。

表3 Tail－PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方式對擴增結(jié)果的影響

DNA質(zhì)量的好壞直接影響Tail－PCR的結(jié)果。袁云香等［15］報道，改良的 SDS法提取的基因組DNA純度及濃度較高，較之CTAB法、簡易法及脲法效果更好。在試驗中分別用SDS法、CTAB法和不經(jīng)酚仿抽提處理的簡易法對材料進行了DNA的提取。結(jié)果顯示，SDS法與CTAB法獲得的DNA作為模板，在Tail－PCR中均可進行良好擴增并得到清晰條帶(圖1－A，圖1－B)，而簡易法獲得的DNA由于純度差、雜質(zhì)多，在Tail－PCR中擴增大多出現(xiàn)彌散，不能很好地獲得目的條帶(圖1－C)。

圖1 不同DNA提取方法的Tail－PCR電泳結(jié)果

2.2 擴增產(chǎn)物稀釋程度對后續(xù)擴增結(jié)果的影響

Tail－PCR需要設(shè)計3條特異引物并進行3輪擴增，第1輪擴增產(chǎn)物作為第2輪擴增的模板，第2輪擴增產(chǎn)物作為第3輪擴增的模板，經(jīng)過3輪擴增得到逐漸富集的目的條帶。由于每輪PCR均產(chǎn)生大量不同種產(chǎn)物，直接以這種產(chǎn)物作為模板會影響后續(xù)擴增的效果，所以在進行后2輪擴增時，需要對作為模板的前一輪擴增產(chǎn)物進行稀釋，一般第2輪擴增會將第1輪擴增產(chǎn)物稀釋40倍使用，第3輪擴增會將第2輪產(chǎn)物稀釋10倍使用［14］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)后2輪擴增產(chǎn)物出現(xiàn)彌散時，適當(dāng)增大模板的稀釋倍數(shù)，可以增加條帶出現(xiàn)率，更好地得到可供分析的擴增結(jié)果(圖2)。

圖2 以不同稀釋倍數(shù)DNA為模板進行擴增比較

2.3 酶對擴增結(jié)果的影響

為了獲得長片段擴增產(chǎn)物，經(jīng)典的Tail－PCR的延伸時間一般為3 min，在本試驗中，很少得到大于2 000 bp的片段，為了排除酶活力不夠?qū)U增產(chǎn)物的影響，用LA Taq酶代替普通的Taq酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LA Taq酶并未獲得更好的擴增結(jié)果(圖3)，在多個株系的試驗中沒有發(fā)現(xiàn)該酶能獲得比普通酶更 長的擴增片段，反而增加了試驗成本。

圖3 不同的酶對擴增效果的影響

2.4 混合簡并引物對擴增結(jié)果的影響

Liu等［14］認為，在第1輪擴增中將4種簡并引物混合可以在當(dāng)輪擴增中獲得更多的條帶，從而達到更好的擴增效果，盡管最終產(chǎn)物中會出現(xiàn)小一些的片段，但是非特異擴增仍能夠有效濾去。此外，對于多株系的分析，混合簡并引物的方法可以在短時間內(nèi)對大量株系進行分析鑒定，從而提高效率。本試驗中，混合簡并引物擴增并沒有產(chǎn)生比分開引物擴增更多的條帶，而混合引物后產(chǎn)物在同一泳道進行電泳，不利于大小一致的帶準確分離。因此，在本試驗中，仍采用4種簡并引物分別擴增的方法。

2.5 簡并引物結(jié)合偏好性分析

利用已報道的4種LAD簡并引物進行Tail－PCR擴增［14］。研究發(fā)現(xiàn)，簡并引物與不同生物材料的DNA結(jié)合的偏好性不同。4種簡并引物中，LAD2更易于與小麥基因組DNA結(jié)合。在選取的3個轉(zhuǎn)基因小麥株系中，LAD2引物均可在Tail－PCR的第3輪檢測中得到擴增結(jié)果，而LAD1在3個材料中均未獲得擴增條帶(圖4－A，圖4－B，圖4－C)。針對旱稻材料，4種LAD引物與旱稻基因組DNA結(jié)合偏好性無明顯差異。在隨機選取的3個轉(zhuǎn)基因旱稻株系中，LAD1、LAD2、LAD3、LAD4 四種簡并引物均可與旱稻基因組結(jié)合并在3輪PCR中獲得擴增結(jié)果(圖 4－D，圖 4－E，圖 4－F)。

圖4 4種簡并引物與小麥、旱稻DNA結(jié)合偏好性比較

3 結(jié)論與討論

Tail－PCR是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)，試驗結(jié)果的好壞與模板質(zhì)量、引物特異性、物種、已知序列特征、試驗條件等諸多因素有關(guān)。本研究以轉(zhuǎn)基因旱稻為材料，對Tail－PCR方法進行了分析優(yōu)化，包括DNA樣品質(zhì)量、擴增產(chǎn)物稀釋程度、酶的種類、簡并引物組合方式、引物結(jié)合偏好性等。優(yōu)化后的Tail－PCR技術(shù)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，可以準確地獲得轉(zhuǎn)基因旱稻的插入位點的旁側(cè)序列。

傳統(tǒng) Tail－PCR 延伸時間為 3 min［14］，在本試驗中，3輪擴增后電泳檢測，很少出現(xiàn)大于2 000 bp的條帶，換用LA酶后仍然如此。因此，為了縮短整個PCR的流程，將程序中的延伸時間都縮短到2.5 min。最終得到的片段雖然不長，但是已經(jīng)可以準確地對外源基因的插入位點進行分析。

Tail－PCR中，需要設(shè)計3條特異引物，如果3條中的任意一條出現(xiàn)問題，會導(dǎo)致整個試驗的失敗。在進行特異引物的設(shè)計時，同時設(shè)計了4條引物，每條引物間距離控制在50～150 bp，退火溫度均為60～65℃。進行PCR時，不同的特異引物組合會出現(xiàn)不同的擴增結(jié)果(即從4條中選3條擴增，可有多種選擇)，從而更易于得到不同轉(zhuǎn)基因株系的側(cè)翼序列。

Tail－PCR由于采用了簡并引物，因此會出現(xiàn)非特異擴增，而非特異擴增由于是隨機出現(xiàn)，所以一般不具備可重復(fù)性。試驗中可以通過重復(fù)擴增來檢驗條帶是否為特異結(jié)果。同時，由于過于短小的片段測序后得不到充分的信息，所以，在回收條帶的選擇上應(yīng)不小于500 bp。

［1］ Liu Y G，Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR:Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking［J］.Genomics，1995，28(3):457-463.

［2］ 鄭岑，張立平，唐忠輝，等.Tail－PCR技術(shù)及其在植物基因中的克?。跩］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(3):544-548.

［3］ 仇艷光，田景漢，葛榮朝，等.Tail－PCR的改良及其在分離小麥基因啟動子中的應(yīng)用［J］.生物工程學(xué)報，2008，24(4):695-699.

［4］ 陳笑蕓，汪小福，劉仁虎，等.不同Tail－PCR通用引物在轉(zhuǎn)基因大豆、水稻、油菜側(cè)翼序列分離中的應(yīng)用評價［J］.核農(nóng)學(xué)報，2013，27(7):922-928.

［5］ 林春燕，郭婧，趙廣榮.熱不對稱交錯PCR克隆bapt基因側(cè)翼序列［J］.化學(xué)工業(yè)與工程，2015，32(1):59-63.

［6］ 張亞敏，楊晶，王愛英，等.天山雪蓮rbcs基因啟動子的克隆及序列分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，23(5):146-152.

［7］ 梁成真，張銳，孫國清，等.優(yōu)化Tail－PCR方法克隆棉花抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子編碼基因［J］.棉花學(xué)報，2010，22(3):195-201.

［8］ 田蕾，郭妍君，任麗，等.利用TAIL－PCR技術(shù)分析擬南芥At1g52910突變體插入位點的側(cè)翼序列［J］.中國野生植物資源，2016，35(4):23-25.

［9］ 李朝煒，馮丹，翟會青，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的旱稻遺傳轉(zhuǎn)化主要影響因素［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(15):3482-3487.

［10］ 李朝煒，劉穎，朱昀，等.旱稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(2):52-54.

［11］ 劉青，李朝煒，朱昀，等.抗逆轉(zhuǎn)基因旱稻轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(11):42-45.

［12］ 邢文岳，蘇樂樂，李朝煒，等.地高辛標記對旱稻進行Southern雜交分析主要影響因素的優(yōu)化和驗證［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(8):41-43.

［13］ 陳昆松，李方，徐昌杰，等.改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA大量提?。跩］.遺傳，2004，26(4):529-531.

［14］ Liu Y G，Chen Y L.High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences［J］.BioTechniques，2007，43(5):649-656.

［15］ 袁云香，孫丙耀.適于Tail－PCR模板的水稻基因組DNA提取方法的優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(9):3964-3966.