胡金山，田安然，耿金鵬*，隋 麗，展 永

(1.河北工業(yè)大學(xué)生物物理研究所，天津300401;2.華北理工大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，河北 唐山063210;3.中國(guó)原子能科學(xué)研究院，北京102413)

玉米(Zea mays L.)原產(chǎn)自南美洲，為1年生禾本科草本植物，是目前全世界產(chǎn)量最高的三大糧食作物之一，其籽粒以黃、白兩色為主。玉米素有長(zhǎng)壽食品的美稱(chēng)，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸、維生素、纖維素以及多糖等，經(jīng)常食用能夠預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病、高膽固醇血癥的發(fā)生［1］。玉米不僅作為糧食和飼料，還廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥、紡織等行業(yè)［2］。全球?qū)τ衩卓偭康男枨笕找嬖鲩L(zhǎng)?，F(xiàn)階段，通過(guò)提高玉米種植面積增加產(chǎn)量已經(jīng)非常困難，因而對(duì)提高玉米單產(chǎn)和改善玉米品質(zhì)提出了更高的要求。除氣候、環(huán)境、土壤等特定因素，玉米遺傳基礎(chǔ)狹窄、種質(zhì)資源相對(duì)匱乏已經(jīng)成為我國(guó)玉米育種的瓶頸［3］。

輻射誘變?cè)趧?chuàng)新、拓展玉米種質(zhì)資源方面發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng)輻射源以χ、γ、β射線(xiàn)和中子為主，但存在育種周期長(zhǎng)、定向突變差等問(wèn)題，限制了輻射誘變育種的應(yīng)用。近年來(lái)，重離子輻射誘變因其束流多樣性、突變頻譜寬、穩(wěn)定周期短等特點(diǎn)開(kāi)創(chuàng)了輻射誘變育種的新途徑［4］。質(zhì)子輻射(PR)盡管原子序數(shù)較低但電離密度大，也屬高傳能線(xiàn)密度輻射(LET)，可將自身所攜帶能量沉積在其徑跡上，產(chǎn)生的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)(RBE)較χ、γ、e等低LET輻射明顯，而其引起的生理?yè)p傷卻明顯小于7Li、12C等重離子［5-6］。20世紀(jì)90年代，我國(guó)科研人員嘗試用加速的高能質(zhì)子輻射誘變植物種子，相繼取得了一系列成果。唐掌雄等［7］用質(zhì)子輻射麥類(lèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M1代苗高和根長(zhǎng)的變化分別與輻照劑量及射線(xiàn)能量有關(guān)。王彩蓮等［8］用質(zhì)子輻射水稻，獲得了矮稈和千粒質(zhì)量顯著增加的突變株。施巾幗等［9］研究了質(zhì)子輻射對(duì)小麥的誘變效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量質(zhì)子輻射對(duì)小麥M1代的有益變異效果不同。質(zhì)子輻射突變頻率高，可以顯著加快育種進(jìn)程，但現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)玉米的輻射誘變研究大多采用γ射線(xiàn)［10］、重離子［5-6］以及航天搭載［11］等方式，研究重點(diǎn)主要集中在細(xì)胞基因組的生理?yè)p傷［12］、生物誘變效應(yīng)［5-6］、突變體的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)［13-14］以及構(gòu)建理論模型［15］等方面，而關(guān)于質(zhì)子輻射誘變玉米的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，利用不同劑量質(zhì)子輻射處理玉米種子，研究其對(duì)發(fā)芽率、成苗率、空稈率、株高、穗位高以及千粒質(zhì)量等生物性狀的影響，同時(shí)采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分子標(biāo)記技術(shù)研究M1代的突變率并進(jìn)行遺傳相似聚類(lèi)分析，系統(tǒng)研究質(zhì)子輻射對(duì)玉米的生物誘變效應(yīng)，初步篩選有益變異株，為提高質(zhì)子輻射效果和選育玉米新品種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及質(zhì)子輻射處理

供試玉米品種為白馬牙玉米，白馬牙玉米因籽粒白色、顆粒偏平而得名，為河北遷安當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)種植品種。采用中國(guó)原子能科學(xué)研究院的HI－13串列加速器對(duì)白馬牙玉米干種子進(jìn)行質(zhì)子輻射，輻射能量為 13.00 MeV/u，傳能線(xiàn)密度為 3.50 keV/μm，輻射劑量分別為 0(CK)、10、20、30、40、50 Gy，每個(gè)劑量處理種子50粒，所有輻射試驗(yàn)均在正常大氣條件下進(jìn)行。

1.2 田間試驗(yàn)及表觀性狀監(jiān)測(cè)

田間試驗(yàn)于2016年在河北省遷安市隆興農(nóng)業(yè)科技示范場(chǎng)進(jìn)行，淺耕施基肥，人工開(kāi)穴單粒點(diǎn)播。不同劑量質(zhì)子輻射處理分別播種50粒種子(株距0.25 m，行距 0.50 m)。根據(jù)植株生長(zhǎng)情況定期灌溉，追肥尿素、磷酸二銨一次。觀測(cè)發(fā)芽率、成苗率、空稈率、葉型、株高、穗位高、千粒質(zhì)量等表觀性狀以及抗病性。重點(diǎn)統(tǒng)計(jì)M1代出苗期第15天的發(fā)芽率、拔節(jié)期第5天的成苗率以及抽雄吐絲期第7天的空稈率(n=50)，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)完熟期收獲前玉米植株的株高、穗位高、千粒質(zhì)量等表觀性狀指標(biāo)(n=20)，以未經(jīng)質(zhì)子輻射處理的M1代玉米表觀性狀指標(biāo)作為對(duì)照(CK)。

1.3 光合速率測(cè)定

在玉米抽雄吐絲期的第8天同一時(shí)間段內(nèi)環(huán)境溫度相對(duì)穩(wěn)定條件下，采用ECA－PB0402光合速率測(cè)定儀(北京益康農(nóng)科技有限公司生產(chǎn))測(cè)定M1代玉米穗位上部第1片葉的光合速率，各輻射劑量處理及CK隨機(jī)測(cè)量20株長(zhǎng)勢(shì)較為接近的植株，取平均值。

1.4 RAPD 分析

DNA提取及相關(guān)檢測(cè):采用 Tiangen公司的DNA提取試劑盒，根據(jù)具體步驟提取CK及各輻射劑量處理M1代玉米抽雄吐絲期葉片DNA，采用凝膠電泳成像系統(tǒng)(1%瓊脂糖凝膠)檢測(cè)。采用UV－765紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)樣品逐一進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增:采用美國(guó)Bio公司的熒光定量PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增程序按95℃ 5 min，37℃1 min，72 ℃ 1.5 min，共 35 個(gè)循環(huán)，額外 72 ℃10 min用于完全延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，1×TAE緩沖液含有EB，最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

PCR體系優(yōu)化及引物篩選:由于PCR體系會(huì)對(duì)RAPD結(jié)果的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，為保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確、可靠以及可重復(fù)性，對(duì)PCR體系進(jìn)行一系列優(yōu)化。優(yōu)化體系如下:采用 25 μL 體系，含 10.8 μL 超純水、2.5 μL buffer、2.5 μL Dye、2 μL dNTP、4 μL 引物、1.2 μL Taq 酶、2 μL DNA 模板。以對(duì)照 DNA 為模板，選用142對(duì)隨機(jī)引物在優(yōu)化體系下進(jìn)行擴(kuò)增，從中選出條帶穩(wěn)定性好、清晰度高、帶型豐富的隨機(jī)引物。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS軟件的單因素方差分析和LSD多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各統(tǒng)計(jì)量定義如下:

發(fā)芽率=(發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%，

成苗率=(成苗株數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%，

空稈率=(空稈株數(shù)/成活總株數(shù))×100%，

多態(tài)性比率=(多態(tài)性條帶數(shù)/對(duì)照擴(kuò)增條帶數(shù))×100%。

根據(jù)RAPD電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)，缺失或增加條帶為陽(yáng)性記為1，與對(duì)照條帶相同擴(kuò)增陰性記為0。采用NTsys軟件對(duì)不同劑量處理及CK進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

觀察田間表觀性狀發(fā)現(xiàn)，質(zhì)子輻射誘變的白馬牙玉米M1代在發(fā)芽、成苗、抽雄、開(kāi)花、散粉、吐絲、成熟等階段都有變異現(xiàn)象出現(xiàn)。20 Gy質(zhì)子輻射處理有3株葉片出現(xiàn)皺縮、卷曲，40 Gy質(zhì)子輻射處理有5株葉片變寬，但上述2個(gè)處理的穗上葉片數(shù)和總?cè)~片數(shù)與CK沒(méi)有明顯差異。10 Gy質(zhì)子輻射處理有1株出現(xiàn)雄性不育，2株花藥由紫色變?yōu)辄S色，2株花絲由紅色變?yōu)榉凵?。另外?0 Gy質(zhì)子輻射處理有4株出現(xiàn)同位多穗現(xiàn)象。10 Gy質(zhì)子輻射處理抗病性整體增強(qiáng)，但20、30 Gy質(zhì)子輻射處理抗倒伏能力整體減弱，抗旱性沒(méi)有明顯變化。10 Gy質(zhì)子輻射處理有6株抽雄期、吐絲期均比CK提前3 d，成熟期也相應(yīng)提前且活稈成熟，而50 Gy質(zhì)子輻射處理有3株成熟期卻比CK晚2 d。

2.1 質(zhì)子輻射對(duì)玉米M1代發(fā)芽率、成苗率和空稈率的影響

玉米發(fā)芽率能夠直觀地顯示種子的萌發(fā)出芽狀況，而成苗率則反映植株的成苗情況。如圖1所示，不同劑量質(zhì)子輻射處理發(fā)芽率均在86%以上，其中，20 Gy處理出苗情況最好，發(fā)芽率高達(dá)98%，輻射劑量繼續(xù)增加，發(fā)芽率總體呈降低趨勢(shì)。質(zhì)子輻射各組成苗率均在84%以上，整體變化趨勢(shì)與發(fā)芽率相似，但略低于發(fā)芽率。空稈率直接影響玉米產(chǎn)量，統(tǒng)計(jì)空稈率對(duì)準(zhǔn)確估算玉米產(chǎn)量有重要意義。與CK相比，10、40 Gy處理誘變的空稈率分別為13.04%、20.93%，而 20、50 Gy 處理空稈率則明顯較低(2%左右)，不同劑量質(zhì)子輻射處理M1代空稈率隨輻射劑量的變化呈典型的馬鞍形雙峰曲線(xiàn)。

圖1 不同劑量質(zhì)子輻射對(duì)玉米M1代發(fā)芽率、成苗率和空稈率的影響

2.2 質(zhì)子輻射對(duì)玉米M1代株高、穗位高、千粒質(zhì)量的影響

相對(duì)穗位(穗位高與株高之比)能在一定程度上反映植株的抗倒伏能力，千粒質(zhì)量則是體現(xiàn)玉米籽粒大小與飽滿(mǎn)程度的一項(xiàng)指標(biāo)，也是田間試驗(yàn)預(yù)測(cè)產(chǎn)量的重要依據(jù)。由表1可知，與CK相比，10、20、40、50 Gy處理玉米株高均顯著增加，而30 Gy處理顯著降低。穗位高只有20 Gy處理顯著增加，整體而言，質(zhì)子輻射對(duì)株高的影響大于對(duì)穗位高的影響。20、30 Gy處理玉米植株的相對(duì)穗位均明顯增高，提示上述2個(gè)劑量處理的植株抗倒伏能力減弱。圖2所示為不同劑量質(zhì)子輻射M1代玉米果穗，10 Gy 處理玉米千粒質(zhì)量高達(dá) 654 g，20、40、50 Gy 處理玉米千粒質(zhì)量也均顯著增加(表1)，隨輻射劑量增加玉米千粒質(zhì)量也呈典型的馬鞍形雙峰曲線(xiàn)變化，提示質(zhì)子輻射對(duì)提高白馬牙玉米產(chǎn)量有潛在的作用。

表1 不同劑量質(zhì)子輻射對(duì)玉米M1代株高、穗位高和千粒質(zhì)量的影響

圖2 不同劑量質(zhì)子輻射處理M1代玉米果穗

2.3 質(zhì)子輻射對(duì)玉米M1代光合速率的影響

光合作用能夠提供玉米生長(zhǎng)發(fā)育所需物質(zhì)和能量，是玉米產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。由圖3可見(jiàn)，不同劑量質(zhì)子輻射處理的白馬牙玉米M1代光合速率隨輻射劑量增加呈典型的馬鞍形曲線(xiàn)變化。其中，10 Gy處理白馬牙玉米M1代的光合速率最高，達(dá)23.48 μmol/(m2·s)，其次是 20、40 Gy 處理，分別為22.01、21.87 μmol/(m2·s)，3 個(gè)處理均顯著高于CK［19.72 μmol/(m2·s)］，而 30 Gy 處理［18.96 μmol/(m2·s)］略低于 CK，50 Gy 處理［19.82 μmol/(m2·s)］基本與CK持平。

圖3 不同劑量質(zhì)子輻射對(duì)玉米光合速率的影響

2.4 玉米突變的RAPD分析

在優(yōu)化反應(yīng)體系下，從142對(duì)隨機(jī)引物中篩選出16對(duì)(表2)，共擴(kuò)增出124個(gè)條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小均在200～3 000 bp。不同劑量質(zhì)子輻射處理玉米基因組DNA均出現(xiàn)不同程度的多態(tài)性，主要表現(xiàn)為電泳條帶的增加或缺失。從圖4可見(jiàn)，與CK相比，引物A2中箭頭所指10、20 Gy處理在800～1 200 bp各增加1個(gè)條帶，而50 Gy處理在800～1 200 bp增加不同的2個(gè)條帶;引物A10中箭頭所指50 Gy處理在800～1 200 bp缺失1個(gè)條帶，10、50 Gy處理在500～800 bp增加相同的1個(gè)條帶，而20、30、40 Gy處理也增加相同的1個(gè)條帶。

表2 RAPD分析選用隨機(jī)引物序列

為系統(tǒng)研究質(zhì)子輻射誘變對(duì)玉米基因組的影響，采用RAPD分別統(tǒng)計(jì)多態(tài)性比率(表3)，不同劑量質(zhì)子輻射誘變的多態(tài)性比率為 20.16% ～32.26%，10、50 Gy處理多態(tài)性比率明顯高于其他劑量處理組，20 Gy處理多態(tài)性比率最低，多態(tài)性比率呈現(xiàn)非線(xiàn)性的變化趨勢(shì)，由此可見(jiàn)，質(zhì)子輻射能夠有效引起玉米基因組的變異。利用NTsys軟件基于遺傳相似度對(duì)不同劑量質(zhì)子輻射處理進(jìn)行聚類(lèi)分析可知(圖5)，整個(gè)質(zhì)子輻射群體在遺傳相似系數(shù)0.69附近聚為兩大類(lèi)，其中20、30、40 Gy誘變處理與CK聚為一類(lèi)，10、50 Gy處理誘變效果相近聚為另一類(lèi)。

圖4 隨機(jī)引物A2、A10擴(kuò)增結(jié)果

表3 不同劑量質(zhì)子輻射對(duì)玉米基因組DNA多態(tài)性的影響

圖5 不同劑量質(zhì)子輻射誘變的聚類(lèi)分析

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)子輻射能夠引起白馬牙玉米M1代明顯的誘變效應(yīng)。不同劑量質(zhì)子輻射處理白馬牙玉米M1代的發(fā)芽率、成苗率均在84%以上，可見(jiàn)，低劑量質(zhì)子輻射處理對(duì)以上指標(biāo)影響不大，但質(zhì)子輻射對(duì)玉米植株的空稈率影響明顯，空稈率隨質(zhì)子輻射劑量的增加呈馬鞍形變化，該指標(biāo)是否穩(wěn)定遺傳需要逐代跟蹤。質(zhì)子輻射對(duì)千粒質(zhì)量以及光合速率的影響也較為明顯，隨輻射劑量增加有增加—降低—增加—降低交替出現(xiàn)的馬鞍形趨勢(shì)。耿金鵬等［16］曾報(bào)道，不同劑量重離子7Li輻射對(duì)玉米自交系永19的株高、穗位高有馬鞍形劑量效應(yīng)。陳學(xué)君等［6］證實(shí)，重離子12C和36Ar輻射處理玉米自交系鄭58對(duì)部分表觀性狀有正負(fù)雙重作用。韓榮飛等［15］綜合能質(zhì)沉積和電荷協(xié)同提出了EMC模型，從理論角度闡述了馬鞍形存活率產(chǎn)生的機(jī)制。不同輻射試驗(yàn)引起的變異情況比較復(fù)雜，因粒子類(lèi)型、射線(xiàn)能量、輻射劑量以及供試材料不同而反應(yīng)不一，推測(cè)馬鞍形劑量效應(yīng)可能是一種普遍的輻射誘變效應(yīng)。

Duncan等［17］系統(tǒng)研究了22個(gè)雜交玉米品種的光合特性，證明光合速率是一個(gè)可以穩(wěn)定遺傳的性狀。于康珂等［18］探索了不同成熟度玉米葉片對(duì)高溫脅迫的光合響應(yīng)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成熟葉片葉綠素含量顯著下降，且不同玉米自交系的光合速率相差較大。本試驗(yàn)測(cè)定光合速率時(shí)所選植株的長(zhǎng)勢(shì)與CK相近，不同劑量質(zhì)子輻射處理引起的植株長(zhǎng)勢(shì)明顯增強(qiáng)或減弱的單株未被測(cè)量。10、20、40 Gy處理植株的光合速率顯著高于CK，這可能是輻射引起玉米葉片細(xì)胞葉綠體合成的增加或突變所致，同時(shí)，對(duì)應(yīng)劑量處理的千粒質(zhì)量也有所增加。但唐掌雄等［7］利用質(zhì)子輻射誘變麥類(lèi)種子發(fā)現(xiàn)，M1代幼苗出現(xiàn)葉綠素缺失的現(xiàn)象。究竟質(zhì)子輻射如何影響玉米葉綠體合成從而影響光合作用，并最終影響千粒質(zhì)量需要更進(jìn)一步研究。如果增強(qiáng)的植株光合速率特性和提高的千粒質(zhì)量指標(biāo)能夠穩(wěn)定遺傳，那么通過(guò)對(duì)輻射誘變后代定向選擇，則有可能培育出光合能力突出的玉米新品種，這對(duì)于培育高產(chǎn)玉米及創(chuàng)新種質(zhì)資源具有重要意義。

自 Williams等［19］和 Welsh 等［20］提出 RAPD 分子標(biāo)記以來(lái)，該技術(shù)因其快速、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)逐漸滲透于基因組研究的各個(gè)方面［21-22］。李謹(jǐn)?shù)龋?3］應(yīng)用RAPD對(duì)航天搭載輻射仙客來(lái)突變株進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，太空環(huán)境對(duì)仙客來(lái)當(dāng)代植株造成了顯著誘變。孫曉莉等［24］采用RAPD分析獲得了60Co γ射線(xiàn)輻照蝴蝶蘭的最佳輻射誘變劑量。DNA分子水平的多態(tài)性檢測(cè)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)，也為探索質(zhì)子輻射誘變玉米的理論機(jī)制提供了依據(jù)。本結(jié)果也證實(shí)，RAPD能有效檢測(cè)玉米基因組的DNA變化，尤其是片段的插入或者刪除。與轉(zhuǎn)基因玉米不同，質(zhì)子輻射誘變并沒(méi)有外源基因的導(dǎo)入，主要是自身遺傳物質(zhì)的同源重組［25］。目前尚未確定引起玉米生物誘變效應(yīng)的相關(guān)基因，下一步仍需要在細(xì)胞或生物大分子層面進(jìn)行研究以闡明質(zhì)子輻射誘變的機(jī)制。

綜上所述，質(zhì)子輻射能夠有效引起玉米M1代的生物誘變效應(yīng)，空稈率、千粒質(zhì)量以及光合速率等生物性狀變異明顯，且均有典型的馬鞍形劑量效應(yīng)出現(xiàn)。10 Gy質(zhì)子輻射顯著提高了白馬牙玉米的千粒質(zhì)量，結(jié)合群體生物性狀認(rèn)為，10 Gy為最優(yōu)輻射劑量。RAPD和聚類(lèi)分析表明，質(zhì)子輻射能夠有效引起玉米基因組的變異，從而引起玉米M1代的生物誘變效應(yīng)?？梢?jiàn)，質(zhì)子輻射是玉米種質(zhì)創(chuàng)新的一種有效手段。

致謝:承蒙中國(guó)原子能科學(xué)研究院北京串列加速器核物理國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和河北省遷安市隆興農(nóng)業(yè)科技示范場(chǎng)航天育種基地提供的幫助，特此感謝!

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