，， ，，龍飛，，

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可導(dǎo)致急、慢性肝炎，肝硬化并最終可能發(fā)展成肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[1]。HBV前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)可在特定位點(diǎn)發(fā)生RNA剪接并逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生剪接變異體，影響HBV的致病性[2]。單剪接型2.2 Kb HBV剪接變異體編碼產(chǎn)生的剪接蛋白(Hepatitis B spliced protein, HBSP)具有重要的生物學(xué)功能[3-5]。本實(shí)驗(yàn)以HBSP作為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選能夠與HBSP相互作用的肝細(xì)胞蛋白，發(fā)現(xiàn)泛轉(zhuǎn)錄表達(dá)因子剪接變異體1(Ubiquitously expressed transcript splice variant 1，UXT-V1)是其靶蛋白。泛轉(zhuǎn)錄表達(dá)因子是NF-κB轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的一個(gè)重要組成部分，可激活NF-κB通路，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6]。研究確證了HBSP-UXT-V1的相互作用及其對(duì)肝細(xì)胞NF-κB通路的影響，借此深入了解HBV的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒與細(xì)胞 酵母表達(dá)重組質(zhì)粒pGBKT7-HBSP(酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒)、真核表達(dá)重組質(zhì)粒phouge-Flag、phouge-HBSP-Flag(用于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBSP的慢病毒細(xì)胞株)、pDsRed-monomer-N1-HBSP、pAcGFP-N1-UXT-V1、pAcGFP-N1-UXT-V2(用于激光共聚焦實(shí)驗(yàn))、pBIND-HBSP 、pACT-UXT-V1(用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交實(shí)驗(yàn))、pCMVTNT-UXT-V1 (用于體外轉(zhuǎn)錄翻譯目的蛋白)、原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-HBSP(用于原核表達(dá)目的蛋白)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存； 相應(yīng)空載體、對(duì)照載體或報(bào)告基因載體pDsRed-monomer-N1、pAcGFP-N1、pBIND 、pACT 、pBIND-Id、pACT-MyoD、pG5luc、pNF-κB-luc，pRL-tk由本實(shí)驗(yàn)室保存。Huh7肝癌細(xì)胞株購自上海細(xì)胞庫；表達(dá)HBSP的Huh7/phouge-HBSP-Flag慢病毒細(xì)胞株及其對(duì)照細(xì)胞株Huh7/phouge-Flag由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2主要試劑 酵母雙雜交相關(guān)試劑購自Clontech公司； DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶購自Gibco公司，胎牛血清購自PAN公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自Life公司； Red anti-FLAG M2 affinity gel 和Hoechst 33342購自 Sigma公司；Protein A & G、 Normal Mouse IgG、anti-UXT(J-19)抗體、AP偶聯(lián)二抗Anti-Rabbit antibody購自SantaCruz公司；TNF-α、anti-FLAG標(biāo)簽抗體購自Cell Signaling Technology公司。TNT兔網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Dual luciferase assay kit)購自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1順序轉(zhuǎn)化法酵母雙雜交篩選 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HBSP以PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，獲得轉(zhuǎn)化菌AH109[pGBKT7-HBSP]，將肝細(xì)胞cDNA文庫再轉(zhuǎn)化入AH109[pGBKT7-HBSP]，最終將轉(zhuǎn)化菌涂布于QDO/X-α-gal/3-AT篩選平板上，選取21d內(nèi)顯現(xiàn)為藍(lán)色的單克隆，從中分離氨芐抗性的獵物質(zhì)粒，將獵物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AH109，而pGBKT7-HBSP或pGBKT7轉(zhuǎn)化Y187菌株，將AH109轉(zhuǎn)化菌與Y187轉(zhuǎn)化菌混合，250 r/min，30 ℃，培養(yǎng)20～24 h，使分別攜帶獵物質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒的AH109與Y187發(fā)生接合(mating)，以AH109[pGADT7-T]×Y187[pGBKT7-p53]做陽性對(duì)照，將接合菌涂布于QDO/X-α-gal/3-AT篩選平板。從平板上挑取陽性菌落，在濾紙上劃線，液氮裂解，以X-gal為底物、固相法檢測(cè)報(bào)告基因β-半乳糖苷酶的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)方法均參照Clontech公司試劑盒說明書。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Huh7肝癌細(xì)胞株以 DMEM培養(yǎng)液 (含10 %胎牛血清)培養(yǎng)于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染前1 d，以胰酶消化細(xì)胞，按每皿種5×105個(gè)細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿。18 h后以Lipofectamine 3 000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方案參照試劑說明書。

1.2.3內(nèi)源性免疫共沉淀 以phouge-HBSP-Flag、phouge-Flag質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞株，48 h后以RIPA裂解液裂解細(xì)胞，加入Red anti-FLAG M2 affinity gel(偶聯(lián)有anti-Flag抗體的瓊脂糖凝珠)沉淀FLAG標(biāo)簽蛋白及與之相互作用的蛋白，從凝珠上洗脫互作的蛋白后，用anti-UXT抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。

1.2.4激光共聚焦 將融合表達(dá)紅色熒光蛋白的質(zhì)粒(pDsRed-monomer-N1-HBSP)和融合表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒(pAcGFP-N1-UXT-V1或pAcGFP-N1-UXT-V2)共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，48 h后，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍。加入1 mL含0.6 μg/mL Hoechst 33342 的PBS，37 ℃孵育5 min。棄上清，用 PBS洗滌3遍，在Zeiss LSM510 META激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況。

1.2.5哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交 將pBIND-HBSP分別與pACT-UXT-V1重組質(zhì)粒和報(bào)告載體pG5luc共轉(zhuǎn)染；以pBIND-Id、pACT-myoD和pG5luc共轉(zhuǎn)染組為陽性對(duì)照，pBIND空載體、pACT空載體和pG5luc共轉(zhuǎn)染組為陰性對(duì)照，pBIND-HBSP和pACT空載體、pG5luc共轉(zhuǎn)染組為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48 h，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)螢火蟲熒光素酶活性值及內(nèi)參海腎熒光素酶活性值。轉(zhuǎn)染及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.6GST-Pulldown 以pCMVTNT-UXT-V1載體為模板，利用TNT兔網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)，體外轉(zhuǎn)錄翻譯[35S]標(biāo)記的目的蛋白。pGEX-4T-1-HBSP和pGEX-4T-1空載體分別轉(zhuǎn)化Rosetta (DE3) 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)菌，0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)、超聲破碎裂解細(xì)菌后取裂解液上清用Glutathione Sepharose 4B Slurry純化，并使GST融合蛋白固定于Glutathione Sepharose 4B Slurry柱子，加入體外轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白，洗滌柱子后，以洗脫液洗脫柱子上與GST融合蛋白結(jié)合的目標(biāo)蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離目標(biāo)蛋白，磷屏盒中曝光過夜，并在磷屏掃描儀上成像。

1.2.7RNA干擾合成siRNA 用于沉默UXT-V1，其序列為： 5′-GGC UGA ACC UCC AGC UUG ATT-3′[7]，該siRNA僅沉默UXT-V1，對(duì)UXT-V2表達(dá)無影響。UXT-V1 siRNA和陰性對(duì)照NC-siRNA(Negative control siRNA，與已知人類基因均無同源性)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。siRNA轉(zhuǎn)染步驟同質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。

1.2.8TNF-α處理與NF-κB報(bào)告基因活性檢測(cè) pNF-κB-luc、pRL-tk共轉(zhuǎn)染Huh7/phouge-HBSP-Flag或其對(duì)照細(xì)胞株Huh7/phouge-Flag，RNA干擾實(shí)驗(yàn)中另外加入U(xiǎn)XT-V1 siRNA或NC-siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染 24 h后，以滅菌PBS輕柔洗滌細(xì)胞2遍，加入含有50 ng/mL TNF-α的無血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)。TNF-α處理9 h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，以雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒裂解細(xì)胞并檢測(cè)NF-κB反應(yīng)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢火蟲熒光素酶活性值及內(nèi)參海腎熒光素酶活性值。轉(zhuǎn)染及檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性(RLU)計(jì)算 以海腎熒光素酶(內(nèi)參基因)的表達(dá)量平衡轉(zhuǎn)染效率，獲得螢火蟲熒光素酶校正值；將各組螢火蟲熒光素酶校正值分別與陰性對(duì)照組的螢火蟲熒光素酶校正值相除，得到相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性(Relative luciferase units，RLU)值。

2 結(jié) 果

2.1HBSP蛋白與UXT-V1在酵母內(nèi)具有相互作用 本實(shí)驗(yàn)選用MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3酵母雙雜交系統(tǒng)，基于酵母細(xì)胞核中GAL4反應(yīng)元件對(duì)4種報(bào)告基因ADE、HIS、MEL、LacZ的調(diào)控。本研究利用順序轉(zhuǎn)化的方法，依次將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HBSP與肝細(xì)胞cDNA文庫轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株，當(dāng)誘餌蛋白HBSP與文庫質(zhì)粒編碼的獵物蛋白相互作用，就能啟動(dòng)上述報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，使轉(zhuǎn)化菌能夠在QDO/X-α-gal/3-AT平板上生長(zhǎng)并顯現(xiàn)藍(lán)色。利用抗生素抗性不同，提取并分離獵物質(zhì)粒，測(cè)序獲知插入的獵物基因序列。本研究得到獵物基因-泛轉(zhuǎn)錄表達(dá)因子剪接變異體1(UXT-V1)，進(jìn)一步將獵物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株，轉(zhuǎn)化子AH109[pACT2-UXT-V1]與Y187[pGBKT7-HBSP]或Y187[pGBKT7]分別進(jìn)行接合實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物涂布于QDO/X-α-gal/3-AT平板上，進(jìn)而用X-gal做底物檢測(cè)報(bào)告基因LacZ的產(chǎn)物β-半乳糖苷酶的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AH109[pACT2-UXT-V1]×Y187[pGBKT7-HBSP]組與陽性對(duì)照組AH109[pGADT7-T]×Y187[pGBKT7-p53]在8 h內(nèi)顯現(xiàn)藍(lán)色，而AH109[pACT2-UXT-V1]×Y187[pGBKT7]組不顯色(圖1)，證明HBSP與UXT-V1在酵母內(nèi)具有相互作用。

1: AH109[pACT2-UXT-V1]×Y187[pGBKT7] 2: AH109[pGADT7-T]×Y187[pGBKT7-p53] 3: AH109[pACT2-UXT-V1]×Y187[pGBKT7-HBSP]圖1 HBSP蛋白與UXT-V1在酵母內(nèi)具有相互作用Fig.1 HBSP could interact with UXT-V1 in yeast AH109

2.2免疫共沉淀驗(yàn)證HBSP與UXT-V1相互作用 對(duì)于酵母雙雜交獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要對(duì)它們分別在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行蛋白相互作用的驗(yàn)證。人類的UXT基因主要以2種剪接變異體形式存在，分別是剪接變異體1(UXT-V1)和剪接變異體2(UXT-V2)[6]。盡管酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)未獲得UXT-V2，但尚不明確在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)HBSP與UXT的2種剪接變異體是否均有相互作用。轉(zhuǎn)染phouge-HBSP-Flag質(zhì)粒使Huh7細(xì)胞過表達(dá)HBSP蛋白，利用偶聯(lián)有anti-Flag抗體的瓊脂糖凝珠免疫共沉淀、UXT單克隆抗體(針對(duì)UXT-V1與UXT-V2的共同結(jié)構(gòu)域)檢測(cè)，Westernblot結(jié)果表明(圖2)，與HBSP融合表達(dá)的FLAG標(biāo)簽抗體可以沉淀Huh7細(xì)胞株內(nèi)源性UXT-V1蛋白，而在同泳道無法檢測(cè)到UXT-V2蛋白條帶(第4泳道)，說明HBSP蛋白與內(nèi)源性UXT-V1之間存在相互作用，而HBSP與UXT-V2應(yīng)沒有相互作用。

圖2 內(nèi)源性免疫共沉淀驗(yàn)證HBSP與UXT-V1相互作用Fig.2 Co-IP assay showing the interaction between HBSP and endogenous UXT-V1 in Huh7 hepatocytes

2.3激光共聚焦證實(shí)HBSP和UXT-V1在Huh7細(xì)胞內(nèi)共定位 為在肝癌細(xì)胞株內(nèi)進(jìn)一步明確HBSP與UXT-V1和UXT-V2之間的相互作用，以融合表達(dá)紅色熒光蛋白的pDsRed-N1-HBSP分別和融合表達(dá)綠色熒光蛋白的pAcGFP-N1-UXT-1及pAcGFP-N1-UXT-2共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，用Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核染色，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。結(jié)果表明(圖3)， HBSP(紅色)主要分布于細(xì)胞漿中， UXT-V1(綠色)大部分定位在細(xì)胞漿中，而UXT-V2(綠色)主要分布在細(xì)胞核內(nèi)；且共定位圖顯示HBSP與UXT-V1(黃色)，而非與UXT-V2在細(xì)胞中共定位。

圖3 激光共聚焦證實(shí)HBSP和UXT-V1在Huh7細(xì)胞內(nèi)共定位Fig.3 Co-localization of HBSP with UXT-V1 in Huh7 hepatocytes

2.4哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交證實(shí)HBSP蛋白和UXT-V1在肝細(xì)胞中具有相互作用 以pACT-UXT-V1、pBIND-HBSP以及報(bào)告基因pG5luc共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞株，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)報(bào)告基因，結(jié)果顯示(見圖4)，pBIND-HBSP和pACT-UXT-V1共轉(zhuǎn)染組，其相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性較對(duì)照組增高5.94倍(n=3，P<0.05)，再一次證明HBSP蛋白與UXT-V1在Huh7細(xì)胞中存在相互作用。

*P<0.05圖4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性Fig.4 Relative luciferase activities in Huh7 cells by mammalian two-hybrid assay

2.5GST-Pulldown 證實(shí)HBSP和UXT-V1在體外具有直接相互作用 GST-Pull down實(shí)驗(yàn)通過在試管內(nèi)表達(dá)2種蛋白產(chǎn)物，排除細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中各種內(nèi)源性蛋白的影響，從而確定2種蛋白之間是否可以發(fā)生直接相互作用。將pGEX-4T-1-HBSP重組質(zhì)粒和pGEX-4T-1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)和純化GST-HBSP融合蛋白和GST蛋白(圖5A)。利用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)獲得35S標(biāo)記的UXT-V1蛋白，將其與結(jié)合在谷胱甘肽柱子的GST-HBSP融合蛋白進(jìn)行Pull-down反應(yīng)，SDS-PAGE電泳分離蛋白產(chǎn)物、凝膠曝光于磷屏，掃描成像，證實(shí)了HBSP蛋白可以和UXT-V1在體外發(fā)生相互作用(圖5B)。

A: 原核表達(dá)純化HBSP蛋白 B：GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)A: Prokaryotic expression and purification of HBSP protein B: GST-Pulldown assay圖5 HBSP與UXT-V1在體外具有直接相互作用Fig.5 In vitro interaction of HBSP and UXT-V1 by GST-Pulldown

2.6HBSP增強(qiáng)NF-κB活性 Huh7/phouge-HBSP-Flag及其對(duì)照細(xì)胞株Huh7/phouge-Flag是本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)HBSP的慢病毒細(xì)胞株(圖6A)，pNF-κB-luc及pRL-tk 共轉(zhuǎn)染Huh7/phouge-HBSP-Flag或其對(duì)照細(xì)胞株Huh7/phouge-Flag，以TNF-α處理細(xì)胞，檢測(cè)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶活性。結(jié)果顯示(圖6B)，轉(zhuǎn)染報(bào)告載體的Huh7/phouge-HBSP-Flag細(xì)胞株經(jīng)TNF-α處理后，相對(duì)螢光值顯著高于Huh7/phouge-Flag組(RLU值 5.23倍 vs 3.82倍，n=3，P<0.05)，提示HBSP能夠增強(qiáng)NF-κB活性。

A：慢病毒細(xì)胞株Huh7/phouge-HBSP-Flag表達(dá)HBSP；B：相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性A: Expression of HBSP in Huh7/phouge-HBSP-Flag cells；B: Relative luciferase units*P<0.05圖6 TNFα處理時(shí)HBSP增強(qiáng)NF-κB活性Fig.6 HBSP enhanced the activities of NF-κB when treated with TNF-α

2.7HBSP與UXT-V1相互作用激活NF-κB 為探討HBSP對(duì)NF-κB的激活作用是否與UXT-V1有關(guān) ，利用UXT-V1特異的siRNA下調(diào)Huh7細(xì)胞株中UXT-V1 的表達(dá)，而UXT-V2表達(dá)不受影響(見圖7A)。同上作TNFα處理，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶活性，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染無關(guān)對(duì)照NC-siRNA、并經(jīng)過TNF-α處理的Huh7/phouge-HBSP-Flag相對(duì)螢光值比Huh7/phouge-Flag組高(見圖7B，4組與2組相比，RLU值 5.16倍 vs 3.87倍，n=3，P<0.05)，此結(jié)果與圖6B一致； UXT-V1 siRNA沉默UXT-V1表達(dá)后，同樣是TNF-α處理，Huh7/phouge-HBSP-Flag組的相對(duì)螢光值略高于Huh7/phouge-Flag組(見圖7B，8組與6組相比，RLU值4.31倍 vs 3.66倍，n=3，P<0.05，且漲幅比Nc-siRNA轉(zhuǎn)染組的4組與2組相比要小)。最后，8組即Huh7/phouge-HBSP-Flag UXT-V1沉默且TNF-α處理組，與4組即Huh7/phouge-HBSP-Flag UXT-V1未沉默且TNF-α處理組比較，前者的相對(duì)螢光值低于后者(RLU值4.31倍 vs 5.16倍，n=3，P<0.05)。以上的數(shù)據(jù)說明，下調(diào)UXT-V1的表達(dá)可部分減弱HBSP對(duì)NF-κB的激活作用，由此證明HBSP對(duì)NF-κB的激活作用與UXT-V1和HBSP的相互作用有關(guān)。

*P<0.05A: Knockdown of UXT-V1 by siRNA; B: Relative luciferase units 圖7 UXT-V1沉默時(shí)HBSP對(duì)NF-κB通路的影響Fig.7 HBSP regulated NF-κB pathway while UXT-V1 knockdown

3 討 論

HBV編碼一種剪接特異性蛋白HBSP (Hepatitis B spliced protein)具有重要致病性：Soussan等[8-9]證實(shí)HBSP可誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，與肝炎、肝硬化有關(guān)；Mancini-Bourgine等[3]的研究發(fā)現(xiàn)HBSP可誘導(dǎo)特異性CTL活性，導(dǎo)致肝臟損傷；Duriez等[10]的研究則從另一個(gè)角度揭示HBSP在肝臟免疫損傷過程的作用，肝臟損傷導(dǎo)致HBSP表達(dá)上調(diào)，HBSP表達(dá)可反過來降低炎癥因子表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)室前期系列研究發(fā)現(xiàn)，HBSP蛋白與組織蛋白酶B相互作用、激活PI3K/Akt通路及MAPK通路，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞株的侵襲能力[4]；HBSP能與纖維蛋白原γ鏈相互作用、干擾機(jī)體凝血，與出血傾向有關(guān)[5]；HBSP通過促進(jìn)肝微粒體環(huán)氧化物水解酶活性、促進(jìn)苯并芘代謝增加，和苯并芘協(xié)同促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[11]；HBSP與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1誘導(dǎo)蛋白1相互作用，促進(jìn)TGFβ1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)其侵襲遷移能力[12]。為了深入了解HBSP致病性，本實(shí)驗(yàn)室曾用不同的方法、不同的實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行多次酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，從不同角度探索可能與HBSP相互作用的肝細(xì)胞蛋白[4-5,11-12]。酵母雙雜交篩選獵物基因可采用順序轉(zhuǎn)化，共轉(zhuǎn)化和接合等方法，本文采用順序轉(zhuǎn)化的方法，此法較共轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化效率高，而較接合法的效率低，但與后兩者相比，順序轉(zhuǎn)化法不僅能一定程度的保存弱相互作用的蛋白，也能有效降低實(shí)驗(yàn)的假陽性率。

人類的UXT基因位于染色體Xp11.23-p11.22區(qū)，屬于α-前折疊素樣家族(prefoldin)成員，UXT蛋白由7個(gè)外顯子編碼，同時(shí)存在兩種剪接變異體[6]：剪接變異體1(UXT-V1)和剪接變異體2(UXT-V2)，UXT-V1比UXT-V2多出其N端12個(gè)氨基酸，且UXT-V1主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，UXT-V2在細(xì)胞核中表達(dá)，由此存在一些功能差異。UXT-V1與TNFα受體相關(guān)因子3(TNFR-associated factor 3，TRAF3)相互作用，從而連接線粒體外膜上的2個(gè)分子-MAVS和TRAF3，觸發(fā)NF-κB的激活以及IFN-β的表達(dá)，在抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[7]。UXT-V1還是TNF受體信號(hào)復(fù)合體組分，與TNF 受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor 2)結(jié)合，阻止TNF 受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白召募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，從而具有抗凋亡的作用[13]。UXT-V1與UXT-V2都能夠與一種Toll樣受體、促凋亡蛋白SARM (sterile a and HEAT armadillo motif-containing protein)相互作用，但在SARM誘導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡過程中卻發(fā)揮著相反的作用：共表達(dá)SARM與UXT-V1導(dǎo)致caspase 8活性下降而抑凋亡，共表達(dá)SARM與UXT-V2則促進(jìn)caspase 8活性而誘導(dǎo)凋亡[14]。另外，UXT-V2，又名ART-27，能夠與雄激素受體(androgen receptor，AR)的N末端結(jié)合，上調(diào)AR的轉(zhuǎn)錄活性，而與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[15]。本研究通過酵母雙雜交篩查實(shí)驗(yàn)，分離得到HBSP的獵物蛋白UXT-V1，但未得到UXT-V2。鑒于UXT兩種剪接變異體功能不同，本研究首先明確HBSP是否與UXT的兩種剪接變異體均存在互作，通過免疫共沉淀、激光共聚焦明確了HBSP僅與UXT-V1而不與UXT-V2結(jié)合，并以哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者在肝細(xì)胞內(nèi)具有相互作用，而GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)又證實(shí)了HBSP和UXT-V1在體外具有直接相互作用。

UXT-V1能與NF-κB p65亞基結(jié)合，促使NF-κB活化入核，并作為NF-κB轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子復(fù)合物的一部分，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，并促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的凋亡[16]。 本研究首先發(fā)現(xiàn)HBSP能夠激活NF-κB，通過沉默UXT-V1，又發(fā)現(xiàn)UXT-V1表達(dá)減少將削弱NF-κB的活化，證明HBSP與UXT-V1的互作能夠促進(jìn)NF-κB通路活化。NF-κB的激活涉及復(fù)雜的調(diào)控過程[17]：在TNFα、IL-1β等炎癥因子刺激下，激活MAPK、AKT等信號(hào)通路，IκB 激酶(IKK)磷酸化而活化、使對(duì)NF-κB有抑制作用的IκBα泛素化降解，NF-κB的2個(gè)亞基p65與p50轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，p65識(shí)別結(jié)合特定的DNA序列，并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，在免疫、炎癥、腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18]。HBSP可能是調(diào)控機(jī)體在HBV急性感染后轉(zhuǎn)為慢性感染狀態(tài)的重要病毒蛋白，HBSP與UXT-V1相互作用如何激活NF-κB信號(hào)通路，以及下游具體的效應(yīng)分子如何影響HBV相關(guān)疾病病程進(jìn)展，相關(guān)研究目前正在進(jìn)行中。

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