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旋毛蟲(chóng)病(trichinellosis)是由毛形線蟲(chóng)屬旋毛蟲(chóng)引發(fā)的一種嚴(yán)重的人獸共患疾病，因生食或半生食含有旋毛蟲(chóng)囊包幼蟲(chóng)的肉類所致，旋毛蟲(chóng)在胃中消化釋放出來(lái)，在腸道中激活[1-2]。近年來(lái)，我國(guó)旋毛蟲(chóng)病暴發(fā)次數(shù)增加，20世紀(jì)初中國(guó)發(fā)生了17次旋毛蟲(chóng)病的暴發(fā)，有828人患病，其中11人死亡[3]。

自2015年屠呦呦獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)以來(lái)，人們對(duì)傳統(tǒng)中藥的關(guān)注度越來(lái)越高。合歡皮為《中國(guó)藥典》收錄的豆科植物合歡的莖皮，具有解郁安神、活血消腫功效[4]。合歡皮的成分主要包括三萜類化合物、黃酮類化合物、木質(zhì)素類化合物、生物堿、多糖等。俞琦等[5]通過(guò)研究證實(shí)了合歡皮的抗炎作用，但是關(guān)于是否是合歡皮中總皂苷成分發(fā)揮作用以及是否對(duì)旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)感染引起的炎癥起作用卻不得而知。本研究通過(guò)計(jì)數(shù)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)，HE染色計(jì)數(shù)囊包幼蟲(chóng)和免疫組化檢測(cè)IL-1β，IL-6，TNF-α，COX-2的表達(dá)，對(duì)合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療旋毛蟲(chóng)感染小鼠的療效進(jìn)行觀察和比較。

1 材料與方法

1.1旋毛蟲(chóng)來(lái)源 旋毛蟲(chóng)(ISS-534)蟲(chóng)株為豬源旋毛蟲(chóng)，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室提供，經(jīng)江蘇省寄生蟲(chóng)病防治研究所保種傳代。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡的ICR雄性小鼠，體重25～30 g，清潔級(jí)，30只小鼠均由江蘇省寄生蟲(chóng)病防治研究所提供，每只小鼠感染300條旋毛蟲(chóng)，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水飲食。

1.3藥品 阿苯達(dá)唑購(gòu)自Sigma公司，藥物由7%吐溫80和3%乙醇溶液配制成懸液[6]，阿苯達(dá)唑的給藥量為50 mg/(kg·d)[7]。

1.4合歡皮總皂苷干粉的制備 合歡皮購(gòu)自無(wú)錫山禾藥業(yè)集團(tuán)，產(chǎn)地浙江。將合歡皮用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，75%乙醇加熱回流2次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，去離子水復(fù)溶，接著用水飽和正丁醇萃取4次，收集正丁醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，再次復(fù)溶，置于真空干燥箱中烘干，制得干粉并稱重。合歡皮總皂苷粉末的給藥量為8 mg/(kg·d)。

1.5動(dòng)物分組與療效觀察 將36只感染旋毛蟲(chóng)的ICR小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。組Ⅰ-Ⅲ為成蟲(chóng)組：組Ⅰ為感染對(duì)照組，組Ⅱ?yàn)楹蠚g皮總皂苷治療組，組Ⅲ為阿苯達(dá)唑治療組；組Ⅳ-Ⅵ為肌幼蟲(chóng)組：組Ⅳ為感染對(duì)照組，組Ⅴ為合歡皮總皂苷治療組，組Ⅵ為阿苯達(dá)唑治療組。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組于感染后第2 d開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥3 d，于感染后第7 d處死，剖取小腸，并切成1 cm小段，取一段放入生理鹽水中于37 ℃中孵育3 h，計(jì)數(shù)小腸內(nèi)成蟲(chóng)[8]；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組于感染后第7 d開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥14 d，于感染后第40 d處死，取出膈肌，其余肌肉組織絞碎，于配好的37 ℃消化液中消化2 h，全部消化后棄去上清，生理鹽水清洗3次，鏡下計(jì)數(shù)肌幼蟲(chóng)[9]。計(jì)數(shù)平均蟲(chóng)數(shù)和減蟲(chóng)率，減蟲(chóng)率=[(感染對(duì)照組-治療組)/感染對(duì)照組]×100%收集Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組小鼠膈肌，固定于10%福爾馬林溶液中，24 h后脫水切片(厚5 μm)，備用。

1.6HE染色計(jì)數(shù)膈肌中肌幼蟲(chóng) 將上述石蠟切片65 ℃烘烤1 h，二甲苯脫蠟后水化，蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化10 s，伊紅染色 3 min，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片[10]。HE染色膈肌中肌幼蟲(chóng)計(jì)數(shù)方法：每只小鼠取1張組織切片，使用正置顯微鏡進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)拍攝5張視野(100×)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中肌幼蟲(chóng)數(shù)。

1.7免疫組化檢測(cè)膈肌中炎癥因子表達(dá) 將上述石蠟切片烘烤、脫蠟、水化，抗原修復(fù)(90-100 ℃檸檬酸溶液水浴20 min)，PBS浸洗5 min×3次，1% Triton X-100室溫反應(yīng)10 min，3%過(guò)氧化氫室溫反應(yīng)15 min，BSA溶液37 ℃封閉30 min，甩去封閉液，滴加一抗(山羊IgG)，4 ℃過(guò)夜，室溫平衡30 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB染色1～2 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染1 min，流水反藍(lán)5 min，鹽酸酒精分化5 s，流水反藍(lán)7 min，中性樹(shù)膠封片后鏡檢[11]。免疫組化陽(yáng)性結(jié)果判定：IL-1β胞漿呈棕黃色色斑或顆粒[11]，IL-6胞漿呈棕黃色染色[12]，TNF-α胞漿呈棕黃(褐)色染色[13]，COX-2胞漿呈棕色或深棕色[14]。免疫組化分析膈肌中炎癥因子平均光密度的方法：每只小鼠取1張組織切片，使用正置顯微鏡進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)拍攝5張視野(400×)，用IMAGE-PRO PLUS 6.0軟件分析各免疫因子平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1合歡皮總皂苷對(duì)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的影響 給藥期間，各組小鼠均正常生長(zhǎng)，飲水飲食正常。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組中可以明顯看出，合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療組的成蟲(chóng)數(shù)較未給藥組均明顯減少，減蟲(chóng)率分別為70.34%和80.02%；從Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組可以看出給予合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑之后，囊包幼蟲(chóng)較未給藥組也明顯減少，減蟲(chóng)率分別為65.60%和90.66% 。各治療組的減蟲(chóng)率與感染對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩組治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 計(jì)數(shù)感染對(duì)照組和給藥組旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)數(shù)
Tab.1 Trichinella spiralis adult and total larval counts in the control and drug-treated groups

組別Studiedgroups旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)計(jì)數(shù)T．spiralisadultcount旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)計(jì)數(shù)T．spiralislarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)x±sPEfficacy(%reduction)感染對(duì)照組Infectedandnon?treated193±1146，177±3675合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins55±80．000??a71．6015，838±9950．000??a65．70阿苯達(dá)唑組Albendazole36±90．000??81．244，644±10400．000??89．94

注：與感染對(duì)照組相比，**P<0.01；與阿苯達(dá)唑組相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

2.2小鼠膈肌HE染色分析 HE染色可見(jiàn)(圖1)，感染對(duì)照組膈肌中有大量的囊包幼蟲(chóng)且幼蟲(chóng)周圍有大量炎癥細(xì)胞，肌纖維出現(xiàn)退化；而給予合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療后，肌纖維退化出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，且囊包幼蟲(chóng)數(shù)和炎癥細(xì)胞都有明顯減少。分析膈肌中幼蟲(chóng)得出合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療組的減蟲(chóng)率分別為71.19%和89.83%，各治療組減蟲(chóng)率與感染對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩組治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 小鼠感染旋毛蟲(chóng)后膈肌蟲(chóng)荷的變化
Tab.2 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

組別Studiedgroups囊包幼蟲(chóng)計(jì)數(shù)Encystedlarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)感染對(duì)照組Infectedandnontreated9±2合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins3±10．000??a71．19阿苯達(dá)唑組Albendazole1±10．000??89．83

注：與感染對(duì)照組相比，**P<0.01；與阿苯達(dá)唑組相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

圖1 小鼠感染旋毛蟲(chóng)后膈肌蟲(chóng)荷的變化Fig.1 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

2.3 免疫組化分析

2.3.1小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá) 各組小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)如下圖(圖2)。感染對(duì)照組小鼠各炎癥因子的表達(dá)明顯高于各給藥組，兩組治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖2 小鼠感染旋毛蟲(chóng)后炎癥因子的變化Fig.2 Changes of inflammatory factors in mice after T.spiralis Infection

分組StudiedgroupsIL?1βIL?6TNF?αCOX?2感染對(duì)照組Infectedandnontreated71．60±24．82118．13±12．52166．87±64．37117．13±7．58合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins20．10±10．63?29．72±10．60??19．14±11．45?45．72±12．40??阿苯達(dá)唑組Albendazole17．94±1．62?17．08±5．76??10．07±2．23?36．80±17．12??

注：與感染對(duì)照組相比，*P<0.05；與感染對(duì)照組相比，**P<0.01

Note: compared with infected control, *P<0.05; compared with infected control, **P<0.01

2.3.2小鼠膈肌COX-2的表達(dá) 各組小鼠COX-2的表達(dá)如圖所示(圖3)。給予合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑之后都會(huì)降低COX-2的表達(dá)，兩組治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖3 小鼠感染旋毛蟲(chóng)后COX-2的變化Fig.3 Changes of COX-2 in mice after T.spiralis Infection

2.3.3小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2表達(dá)平均光密度的改變 詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討 論

中藥是中華民族的瑰寶，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的寶貴財(cái)富。合歡皮總皂苷作為傳統(tǒng)中藥合歡皮的主要成分之一，具有安全、低毒等優(yōu)點(diǎn)，迄今為止未見(jiàn)有關(guān)該藥對(duì)旋毛蟲(chóng)的作用的報(bào)道。本研究以小鼠為研究動(dòng)物模型，觀察感染后7 d(腸道期)和40 d(肌肉期)時(shí)藥物對(duì)旋毛蟲(chóng)的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑?qū)δc道內(nèi)成蟲(chóng)和肌肉內(nèi)幼蟲(chóng)均有較好的療效，合歡皮總皂苷對(duì)成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)的減蟲(chóng)率分別為71.60%和65.70%。阿苯達(dá)唑?qū)Τ上x(chóng)和幼蟲(chóng)的減蟲(chóng)率分別為81.24%和89.94%。雖然合歡皮總皂苷組的效果略次于阿苯達(dá)唑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是其使用劑量明顯低于阿苯達(dá)唑。眾多文獻(xiàn)中均已指出阿苯達(dá)唑?qū)πx(chóng)感染各期均有較好的治療作用[15-16]。

宿主感染旋毛蟲(chóng)后會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的單核因子，例如IL-1β、IL-6、TNF-α等。IL-1β是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞損傷或應(yīng)對(duì)一些危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)起關(guān)鍵作用[17]。TNF-α是一種強(qiáng)效促炎因子，它以多效性方式對(duì)多種細(xì)胞起生物學(xué)作用，并且在慢性炎癥的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。很多證據(jù)表明，旋毛蟲(chóng)感染后宿主肌肉內(nèi)各種炎癥介質(zhì)會(huì)過(guò)度表達(dá)，繼而引起肌炎等炎癥相關(guān)的疾病的發(fā)生。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)旋毛蟲(chóng)感染小鼠合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療后小鼠肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，結(jié)果顯示兩組給藥組肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)明顯低于感染對(duì)照組，并且兩組治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

COX-2作為調(diào)節(jié)前列腺素和凝血惡烷產(chǎn)生的酶，其產(chǎn)量增多可引起疼痛和炎癥反應(yīng)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)兩組給藥組同樣可以減少COX-2的表達(dá)，且效果十分顯著。綜上所述，中藥合歡皮總皂苷具有抗小鼠旋毛蟲(chóng)感染的作用，并且合歡皮總皂苷可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，減輕炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生，其效果可與阿苯達(dá)唑比擬，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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