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單核增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是人獸共患傳染病重要病原之一。由該菌引起感染發(fā)病率雖低，但病死率極高。在醫(yī)學(xué)臨床中可以引起腦炎、孕婦流產(chǎn)以及敗血癥等[1]。在獸醫(yī)臨床中牛羊易感，表現(xiàn)為敗血癥、神經(jīng)癥狀即“轉(zhuǎn)圈病”、孕畜流產(chǎn)等，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了一定的損失[2]。LM致病性與其所攜帶的毒力因子有著密切的關(guān)系，如溶血素，肌動蛋白、磷脂酶、毒力因子調(diào)節(jié)蛋白、內(nèi)化素、以及鞭毛蛋白等，不同的毒力因子發(fā)揮的作用不盡相同[3]。

細(xì)菌產(chǎn)生的生物被膜(bacterial biofilm, BF)能夠增強(qiáng)細(xì)菌生存能力，抵抗環(huán)境壓力、抗菌藥物以及宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊[4]。BF能依靠細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu)，如糖萼、菌毛、鞭毛等黏附于敏感細(xì)胞[5]，促進(jìn)BF的產(chǎn)生，進(jìn)而直接或者間接地增強(qiáng)了細(xì)菌的毒力。細(xì)菌的鞭毛是由鞭毛絲亞基蛋白組裝而成的細(xì)菌運(yùn)動器官，與細(xì)菌的致病力有重要的關(guān)系。在對某些大腸桿菌菌株研究時發(fā)現(xiàn)缺失編碼鞭毛蛋白基因后，細(xì)菌喪失了對腸上皮細(xì)胞的黏附和侵襲功能，顯著下調(diào)Ⅰ型菌毛的表達(dá)量。同時也證明鞭毛的運(yùn)動性是大腸桿菌BF形成初期與后期成熟過程中的決定性因素，而且在BF形成初期鞭毛更是作為黏附因子促進(jìn)細(xì)菌的黏附，進(jìn)而明顯增強(qiáng)細(xì)菌的毒力[6]。

新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室以發(fā)生“轉(zhuǎn)圈病”的綿羊病例分離并鑒定到LM，命名為LM90 SB2。該菌攜帶鞭毛基因(flaA)，但flaA對LM90 SB2的致病性和BF形成方面的影響尚未見詳細(xì)報道。因此本研究以LM90 SB2為研究對象，在構(gòu)建flaA基因突變株基礎(chǔ)上，通過對比野毒株和突變株的BF形成能力，小鼠LD50等變化，分析flaA對LM90 SB2毒力的影響，為LM的致病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供有用數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 LM90SB2野毒株由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存；pKSV7 穿梭質(zhì)粒由本實驗室保存；Taq DNA 聚合酶、dNTPs等均購自TaKaRa 公司。

1.2引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中的LM 4b血清型的flaA(登錄號：HF558398.1)序列為模板，設(shè)計實驗所需引物：上下游同源臂的擴(kuò)增引物為ΔflaA-F1,2和ΔflaA-R1,2；SOE-PCR的引物為ΔflaA-F1、ΔflaA-R2；檢測引物為ΔflaA-J1,2和ΔflaA-J3,4。引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，詳見表1(下劃線分別表示酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ，斜體部分為保護(hù)堿基)。

表1 構(gòu)建LM flaA基因突變株特異性引物
Tab.1 Specific primers for construction of flaA gene deletion strain of LM

Primers5′?3′SequenceFragmentsize/bpAnnealingtemperature/℃ΔflaA?F1GGAATTCCATCGTATCCAACGTATTTC78655ΔflaA?F2TTGTGTTTCCCTCCTACAGATAAATGAATTTGATATGTTAΔflaA?R1TAACATATCAAATTCATTTATCTGTAGGAGGGAAACACAA76260ΔflaA?R2CGGGATCCTCGTTGCGGACATCCCTTTAΔflaA?J1TTGTGAACCTTGCCCGTGTG974/194155ΔflaA?J2ATCTTAACTTTGGCTCTGCGΔflaA?J3TTTTATTGCCGAGGACTCAC1476/244353ΔflaA?J4GATATCCGAAACCATTGTTT

Note: The underscore indicates the restriction sitesEcoR I andBamHI, respectively, and the italicized moiety is the protecting base.

1.3LM90 SB2的flaA基因突變株的構(gòu)建

1.3.1flaA基因上下同源臂擴(kuò)增、融合重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔflaA的構(gòu)建 以LM90 SB2基因組為模板利用設(shè)計的引物(表1)ΔflaA-F1,2和ΔflaA-R1,2分別擴(kuò)增flaA基因的上下游同源臂，利用引物ΔflaA-F1和ΔflaA-R2經(jīng)過融合后得到融合片段ΔflaA與pMD19-T (simple)連接，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切驗證正確后送至北京睿博興科生物公司測序。將測序正確的融合片段與酶切后pKSV7連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔflaA。

1.3.2LM90 SB2基因突變株LM90 SB2-ΔflaA的構(gòu)建 將純化后的重組質(zhì)粒pKSV7-ΔflaA電轉(zhuǎn)入LM90 SB2感受態(tài)細(xì)胞中，在氯霉素和42 ℃溫度壓力下傳代，經(jīng)兩種檢測引物ΔflaA-J1,2(完全重組后產(chǎn)物974 bp，野毒株產(chǎn)物1 941 bp)和ΔflaA-J3,4(完全重組后產(chǎn)物1 476 bp，野毒株產(chǎn)物2 443 bp)分別檢測同源重組情況，構(gòu)建LM90 SB2的flaA基因突變株。

1.4LM90 SB2-ΔflaA部分生物學(xué)特性的研究

1.4.1菌落形態(tài)、遺傳穩(wěn)定性及生長曲線的測定 將LM90 SB2-ΔflaA與LM90 SB2在BHI平板上劃線后觀察菌落形態(tài)；挑取LM90 SB2-ΔflaA與LM90 SB2的單菌接入BHI培養(yǎng)基，每隔2 h取樣稀釋涂板，進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.4.2運(yùn)動性的測定 分別將LM90 SB2-ΔflaA與LM90 SB2對數(shù)生長期的菌液接種于半固體培養(yǎng)基中，在25 ℃條件下靜置培養(yǎng)36 h觀察觀察菌株的運(yùn)動性。

1.4.3BF形成能力的形態(tài)觀察 將LM90 SB2-ΔflaA與LM90 SB2培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600≈0.500)的菌液加入96孔板，分別于2、6、10、12 h時棄去培養(yǎng)板培養(yǎng)液結(jié)晶紫染色15 min后在倒置顯微鏡(300×)下觀察BF形成情況。

1.4.4小鼠半數(shù)致死量的測定(LD50) 將 LM90 SB2-ΔflaA與LM90 SB2稀釋成不同稀釋度，腹腔注射6周齡昆明系小鼠。用寇氏改良計算法計算獲得LD50的值。

2 結(jié) 果

2.1LM90 SB2-ΔflaA突變株的構(gòu)建

2.1.1ΔflaA融合片段連接pMD19-T和pKSV7質(zhì)粒結(jié)果 通過PCR和融合PCR得到的1 548 bp的融合片段與pMD19-T連接酶切后得到與預(yù)期大小為1 548 bp一致的目的條帶(圖1A)。構(gòu)建的重組pKSV7質(zhì)粒酶切后也得到與預(yù)期值相符的1 548 bp的條帶(圖1B)。

2.1.2同源重組構(gòu)建LM90 SB2-ΔflaA將pKSV7-ΔflaA電轉(zhuǎn)入LM90 SB2感受態(tài)細(xì)胞中，傳代培養(yǎng)后經(jīng)檢測引物ΔflaA-J1、J2(重組后產(chǎn)物974 bp，野毒株產(chǎn)物1 941 bp)和ΔflaA-J3、J4(重組后產(chǎn)物1 476 bp，野毒株產(chǎn)物2 443 bp)檢測和測序后得到陽性轉(zhuǎn)化子(圖2)，成功構(gòu)建flaA突變株并命名為LM90 SB2-ΔflaA。

A.M：DL5000 DNA marker；1：target product；2～5：pMD19-T-ΔflaA B.M：DL5000 DNA marker；1：pKSV7；2～5：pKSV7-ΔflaA圖1 pMD19-T-ΔflaA與pKSV7-ΔflaA雙酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of pMD19-T-ΔflaA, pKSV7 plasmid and pKSV7-ΔflaA by double enzyme

A.(J1，J2) M:DL2000 DNA Marker; 1: Control group; 2: Single exchange strain; 3,4: LM90 SB2-ΔflaA; 5: LM90 SB2 B.(J3，J4) M:DL5000 DNA Marker; 1～4:LM90 SB2-ΔflaA; 5,6：LM90 SB2圖2 同源重組菌采用J1、J2和J3、J4引物的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR results of homologous recombinant strains with primerJ1, J2 and J3, J4

2.2LM90 SB2-ΔflaA部分生物學(xué)特性的研究

2.2.1菌落形態(tài)、遺傳穩(wěn)定性及生長曲線的測定結(jié)果 兩種菌落形態(tài)相似，均為圓形、直徑約1 mm、半透明、邊緣整齊的乳白色菌落(圖3-A)。在無氯霉素抗性37 ℃?zhèn)髦?0代后遺傳穩(wěn)定性良好。LM90 SB2-ΔflaA與LM90 SB2的生長均在8～10 h進(jìn)入穩(wěn)定期，但每個時間段LM90 SB2-ΔflaA細(xì)菌數(shù)量均明顯低于LM90 SB2，且差異顯著(P<0.05)(圖3-B)。

A： ①：LM90 SB2；②：LM90 SB2-ΔflaA B：Growth curves of LM90 SB2 and LM90 SB2-ΔflaA at 37 ℃圖3 LM90 SB2和LM90 SB2-ΔflaA在固體培養(yǎng)基上形成的菌落以及37 ℃條件下的生長曲線Fig.3 LM90 SB2 and LM90 SB2-ΔflaA colonies formed on BHI solid culture medium and growth curves at 37 ℃

2.2.2運(yùn)動性的測定 在25 ℃環(huán)境半固體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)后，LM90 SB2-ΔflaA的運(yùn)動能力下降明顯(圖4)，暈圈直徑由LM90 SB2的1.38 cm，LM90SB2-ΔflaA為0.50 cm，運(yùn)動能力下降了63.77%。

A：LM90 SB2；B：LM90 SB2-ΔflaA圖4 在25 ℃條件下LM90 SB2與LM90 SB2-ΔflaA的運(yùn)動能力測定結(jié)果Fig.4 Comparison the LM90 SB2 and LM90 SB2-ΔflaA in kinetic capacity at 25 ℃

2.2.3BF形成能力的顯微鏡觀察 LM90 SB2在2 h時BF初步形成，進(jìn)入初始粘附期(圖5-A)；2～6 h BF逐漸形成較為完整的矩陣網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，處于粘附期和持續(xù)生長期(圖5-B)；10 h BF矩陣結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且明顯，形成完整的膜樣結(jié)構(gòu)，處于穩(wěn)定期(圖5-C)；12 h后BF的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)松散，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸散落進(jìn)入BF的散播期(圖5-D)。LM90 SB2-ΔflaA在2 h形成的BF只有少量的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖5-E)，2～6 h內(nèi)BF處于粘附期和持續(xù)生長期但BF的生成量較少且松散(圖5-F)，在10 h時BF形成較穩(wěn)定但網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)但致密性差(圖5-G)，12 h后LM90 SB2-ΔflaA的BF結(jié)構(gòu)逐步松散進(jìn)入散播期(圖5-H)。

2.2.4小鼠半數(shù)致死量的測定結(jié)果 根據(jù)寇氏改良劑算法計算得LM90 SB2-ΔflaA與LM90 SB2的半數(shù)致死量分別為4.27×106cfu和1.62×107cfu，半數(shù)致死能力下降了3.8倍。

3 討 論

研究表明細(xì)菌的鞭毛在介導(dǎo)黏附感染時既可以通過自身的運(yùn)動性非特異性增加細(xì)菌與受體細(xì)胞之間的接觸概率促進(jìn)黏附，達(dá)到侵入感染的目的，又可以通過自身的鞭毛蛋白特異性與被感染細(xì)胞的鞭毛受體結(jié)合來完成細(xì)菌的黏附和侵襲[7-8]。痢疾桿菌的flaA基因缺失后運(yùn)動性降低了62 %，對宿主的毒力也明顯降低[9]。缺失F18鞭毛大腸桿菌對IPEC-1和IPEC-J2細(xì)胞的黏附能力顯著下降，說明鞭毛在F18+大腸桿菌對宿主細(xì)胞的黏附過程中同樣起重要的作用[10]。本研究通過構(gòu)建LM90 SB2的flaA基因突變株后發(fā)現(xiàn)鞭毛不能正常形成，運(yùn)動能力下降了63.77%，對環(huán)境的適應(yīng)能力下降。由于LM90 SB2-ΔflaA進(jìn)入機(jī)體后除了自身的運(yùn)動性降低外，其自身的鞭毛蛋白合成降低，進(jìn)而不能與宿主細(xì)胞上的對應(yīng)的受體結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而黏附和侵襲能力降低，是引起LD50升高的原因之一。

此外鞭毛既能使靜態(tài)或者流動狀態(tài)的菌體更容易聚集，其帶來的運(yùn)動性又能在BF形成過程中的某些階段起到關(guān)鍵作用[11-13]，BF的形成和發(fā)展而產(chǎn)生的耐藥性是許多持續(xù)性感染和慢性感染的主要因素，因此鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動性和黏附性能通過促進(jìn)BF的形成而間接地參與細(xì)菌的致病性[6]。曾經(jīng)的研究表明LM90 SB2能形成完整且致密的BF[14]。而本研究中構(gòu)建LM90 SB2-ΔflaABF形成規(guī)律雖然未發(fā)生改變，但每個階段BF形成量明顯減少，且結(jié)構(gòu)更加松散，矩陣狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)致密性降低，但BF形成能力并未完全失去。表明flaA基因編碼的鞭毛蛋白在LM90 SB2形成BF的各個階段都發(fā)揮著一定的作用。

A, B, C, D: LM90 SB2 at 2 h, 6 h, 10 h, 12 h E, F, G, H: LM90 SB2-ΔflaA at 2 h, 6 h, 10 h, 12 h圖5 LM90 SB2和LM90 SB2-ΔflaA在不同時間BF結(jié)構(gòu)(300×)Fig.5 BF produced by LM90 SB2 and LM90 SB2-ΔflaA at different time points (300×)

本研究結(jié)果表明flaA基因能編碼LM90 SB2鞭毛，鞭毛直接或者間接影響了LM90 SB2BF的形成和LD50。這為探索LM90 SB2引起綿羊腦炎致病機(jī)制提供了依據(jù)。

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