， ，，，，，

流行性感冒病毒(influenza virus)，簡稱流感病毒，自流感被發(fā)現(xiàn)以來，每年在全球范圍內都有季節(jié)性流行[1]，流感病毒的基因分子進化及疫苗研究一直是各地學者研究的熱點。流感H3N2亞型在流感暴發(fā)流行歷史中扮演重要角色，其一直在人群中流行傳播，并發(fā)生變異。流感病毒的抗原性變異主要指血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)抗原結構的改變，其中以HA最為重要，變異也最為顯著[2]，世界衛(wèi)生組織(WHO)推出疫苗株也一再更新。從近幾年全球的流行病學調查分析可以看出，H3N2亞型在大多數國家是流感流行的優(yōu)勢毒株，我國也以甲型H3N2病毒為優(yōu)勢株。僅1968-1992年間我國發(fā)生的10次流感，其中就有7次都是由H3N2亞型流感病毒所引起[3]。商洛市對流感研究起步較晚，開始于2009年流感疫情再次席卷全球。本課題依托中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)平臺，收集2014-2015年商洛市國家流感網絡實驗室流感H3N2亞型毒株，了解商洛市流感病毒進化規(guī)律，以及流行趨勢，與WHO推薦標準疫苗株及國內毒株進行比對，研究流行株與疫苗匹配性，為當地流感高危人群選擇性預防接種工作提供參考，對減少發(fā)病率，減輕公共衛(wèi)生預防控制工作負擔有重要意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 根據《全國流感監(jiān)測技術指南(2010年版)》(下文簡稱《指南》)，收集流感監(jiān)測哨點醫(yī)院商洛市中心醫(yī)院流感樣病例(influenza-like illness, ILI)，ILI是指發(fā)熱(體溫大于等于38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者，同時缺乏其他實驗室診斷依據。用病毒采樣管(友康)2～8 ℃冷藏保存，12 h內送商洛市疾病預防控制中心國家流感監(jiān)測實驗室。

1.2儀器與試劑 全自動核酸提取儀(西安天隆NP968)；全自動熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(上海宏石SLAN-96P)；PCR儀(美國Bio-Rad PTC-200)；電泳儀(北京六一DYY-2C)；凝膠成像儀(海南黑馬GSG-2000)。核酸提取由西安天隆提供配套商品試劑盒；實時熒光PCR(Real-time PCR)A、B及H3亞型分型采用上海之江商品試劑盒；MDCK細胞由陜西省疾病預防控制中心提供；鑒定血清由中國疾病預防控制中心國家流感中心提供；PCR使用QIAGEN公司One Step RT-PCR Kit試劑盒。

1.3 方法

1.3.1核酸檢測 對流感哨點醫(yī)院ILI標本用全自動核酸提取儀提取核酸(按產品說明書操作)，用上海之江核酸檢測試劑對核酸提取物進行Real-time PCR檢測(按產品說明書操作)。

1.3.2病毒分離培養(yǎng) 將核酸檢測陽性標本用單層狗腎傳代細胞(MDCK)進行分離培養(yǎng)，收集細胞病變(CPE)“+++”～“++++”的樣本，用豚鼠血球或火雞血球進行血凝試驗(HA)，陽性毒株(HA>1∶8)用血凝抑制試驗(HI)進行鑒定分型。

1.3.3序列測定 將鑒定為H3標本病毒培養(yǎng)液用全自動核酸提取儀提取核酸，具體操作見說明書；提取核酸進行RT-PCR擴增，引物設計及合成由上海之江生物公司提供(引物合成自Thermo Fisher)，引物序列見表1；PCR后，用1%瓊脂糖凝膠電泳；陽性條帶送上海美吉生物醫(yī)學有限公司測序。

表1 引物核苷酸序列
Tab.1 The nucleotide sequence of the primer

PrimerSequenceTmLength/bpYF?HA?H3?35′?ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGC?3′59768YF?HA?H3?95′?TCCCGGTTTTACTATTGTCCA?3′59．3YF?HA?H3?55′?TCAAAAYGGAACAAGCTCTGC?3′60．4676YF?HA?H3?65′?TTGATGCCTGAAACCGTACC?3′60．9YF?HA?H3?75′?TGAAATTGGCAACAGGGAT?3′58．9714YF?HA?H3?85′?CTCAAATGCAAATGTTGCAC?3′57．8

1.3.4序列分析 將所得的測序結果應用clustax2.1軟件進行序列比對后，應用Mega 6.0軟件，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，系統(tǒng)進化樹采用Neighboring-joining方法及Kimura-2-Parameter模式進行繪制，Bootstrap值進行1 000次重復運算。以WHO推薦2014-2015年H3N2標準疫苗株A/Texas/50/2012[4]為對照進行氨基酸變異分析。

2 結 果

2.1HA1片段的序列分析與同源性分析 本研究得到毒株的HA1序列為987 bp，編碼329個氨基酸。以A/HongKong/1/1968的HA1基因為基準，對分離H3N2毒株HA1基因構建核苷酸序列進化樹，見圖1。季節(jié)性H3N2的HA1基因在不斷變異，進化基本按時間順序逐漸演變，但2014-2015年在進化樹上有交替過渡出現(xiàn)。2014-2015年分離毒株同源性在97.2%～99.9%，分離毒株與2014-2015年標準疫苗株A/Texas/50/2012同源性為97.3%～98.5%(表2)。

表2 流感H3N2基因HA1同源性分析
Tab.2 Analysis homology of the HA1 genes of influenza A(H3N2)

2.2H3N2亞型流感病毒HA1特異性分析 2014年商洛市分離的H3N2毒株與2014-2015年推薦疫苗株A/Texas/50/2012相比，其HA1亞基氨基酸變異點主要有I3L、T128N、Y159F、K171N、S198P、I312K、E322G；2015年商洛市分離的H3N2毒株與2014-2015年的疫苗株A/Texas/50/2012(H3N2)相比，其HA1亞基氨基酸變異點主要有N124S、A128N、S138A、G142R、S159F、S198P、G223E、E260K、T313A、E322G、D327N，見表3。

表3 流感H3N2亞型HA1基因氨基酸變異分析
Tab.3 Amino acid variation of HA1 nucleotide of influenza A(H3N2)

StrainsAminoacidvariationsites3124128138142159171198223260312313322327A/Texas/50/2012＿VaccineLSNARFNPEKKAGNA/ShangLuo/06/2014--T--Y-S--I-E-A/ShangLuo/173/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/182/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/244/2014I-T--YKS--I-E-A/ShangLuo/04/2015-NASGS-SGE-TEDA/ShangLuo/15/2015-NASGS-SGE-TEDA/ShangLuo/30/2015-NASGS-SGE-TED

2.3HA1潛在糖基化位點 HA蛋白在細胞轉移中進行糖基化加工修飾，H3N2HA蛋白至少有7個N糖基化位點，其中6個位于HA1，其序列為N-X-T/S(N-天冬氨酸,T-蘇氨酸,S-絲氨酸,X-任意氨基酸)。HA1分子含有大量的糖類，大部分位于氨基酸的末端，其位點增加或減少對流感病毒的抗原性及其他生物學特性均有一定影響[5]。用在線糖基化預測分析潛在的糖基化位點[6]。2014-2015年商洛市分離毒株的HA1的氨基酸與疫苗株A/Texas/50/2012相比糖基化位點沒有變化。

2.4二硫鍵的變化 流感病毒HA蛋白分子上有6個二硫鍵，其中5個位于HA1區(qū)，包括HA1第14位的半胱氨酸與HA2第137位的半胱氨酸之間形成的將HA1和HA2相連的二硫鍵；其余4個二硫鍵分別為HA1的52與277、62 與67、97 與139、281 與305的半胱氨酸之間形成的二硫鍵[7-9]。本次研究分析中2014-2015年度商洛市的流感毒株的HA1區(qū)5個二硫鍵均未發(fā)現(xiàn)氨基酸替換、缺失和插入。

3 討 論

2009年以來，商洛市流感病毒流行株主要在A型H1N1(2009)、季節(jié)性H1、H3N2及B型Yamagata、Victoria亞型之間交替出現(xiàn)，當流感出現(xiàn)一種新的亞型，由于人群缺乏特異性的免疫，人類普遍易感。商洛市位于北方片區(qū)，屬于暖溫帶半濕潤季風山地氣候，流感流行季節(jié)明顯，流行高峰一般會在每年11月到次年3月份左右，夏秋季流感病例很少檢出。從2012-2015年，流感H3N2亞型逐漸增多并成為北方地區(qū)優(yōu)勢毒株流行株[10-11]，其主要原因：一是流感變異速率快、幅度大，容易逃脫宿主的識別和清除，缺乏依賴RNA的RNA聚合酶的校正作用，導致毒株變異；二是受人群免疫力自然選擇的壓力。本研究中流感H3N2亞型HA1基因進化樹沿主干隨時間逐漸向上延伸，其分支較短，提示毒株變異很快，且2014-2015年毒株有交替出現(xiàn)。從進化樹可以看到2014年毒株與疫苗株A/Texas/50/2012距離較近，而2015年毒株則與疫苗株A/Texas/50/2012較遠，說明商洛市H3N2毒株受到的人群免疫力較大。

流感病毒的HA蛋白以三聚體(trimer)的形式存在于雙層類脂膜上，由3個非共價結合的HA蛋白單體所組成。HA蛋白三聚體可分為呈桿狀的基底部及呈球狀的頭部，HA1主要組成其頭部。病毒受體結合位點(RBS)位于HA頭部，呈淺袋狀，其中98Y、153 W、155T、183H、190E和194L的氨基酸殘基組成口袋裝的表面；224位～228位和134位～138位這2個區(qū)域分別構成受體結合部位的左右緣[12]。大部分流感病毒株HA1的5個氨基酸(98、153、183、190 和 194)是高度保守的，不參與RBS位點與受體結合，可能對穩(wěn)定RBS結構、促進病毒與受體結合和病毒繁殖等生理功能起到重要的作用[13-14]。2015年商洛市分離毒株發(fā)生S138A變異，提示病毒結合位點空間結構有可能改變，應當引起重視，這與羅鵬飛[15]等人研究結果相同。此外RBS的某些結構組成部分結構及其位點發(fā)生了變異，說明這些RBS結構組成部分可能同時作為抗原抗體的相互作用位點，宿主的細胞免疫可能參與了對抗流感病毒的過程[16]。

X線晶體結構研究發(fā)現(xiàn)，H3N2亞型流感病毒HA蛋白上的抗原決定簇分為5個區(qū), A 區(qū)包括133～137位和140～146位形成的突出的環(huán)上, B區(qū)位于155位上的主環(huán)156～160位及球區(qū)末端圍繞著α 螺旋結構的187～198位。C區(qū)位于球區(qū)下方的 53、54、275、278位, 由52位和277位的形成的膨脹部分所在區(qū)。D區(qū)由207位和174位組成。E區(qū)由63、78 、81、83位組成[17]。流感HA1氨基酸在快速、持續(xù)不斷的發(fā)生突變，但主要是以嘌呤A/G或嘧啶C/T互換最為常見，嘌呤與嘧啶間的置換較少。近幾年，由于很難獲得雞胚分離的H3N2亞型流感病毒，且H3N2亞型流感病毒在雞胚分離時抗原決定簇發(fā)生適應性突變，因此WHO推薦使用A/Texas/50/2012-likevirus作為疫苗組分[18-19]。2014-2015年商洛市分離H3N2毒株與WHO推薦疫苗株HA1基因氨基酸比較，2014年其主要抗原決定簇氨基酸變異點有B區(qū)Y159F、S198P；2015年主要抗原決定簇氨基酸變異點有A區(qū)G142R，B區(qū)S159F、S198P，馬萍[20]等在陜西省2011-2013年H3N2流感流行趨勢分析中發(fā)現(xiàn)2011-2012年抗原變異有B區(qū)S198A位,2012-2013年抗原變異位點有A區(qū)G142R，李希妍[21]等對2013-2014年中國H3N2亞型研究發(fā)現(xiàn)HA基因序列也有G142R、S198P位點變異。流感病毒在細胞培養(yǎng)或雞胚分離傳代中會產生序列變異，但結合本地區(qū)流感H3N2亞型流行株與中國疾病預防控制中心上述相關研究，A/Texas/50/2012疫苗株已連續(xù)使用兩年，而且對流行株與疫苗株抗原決定簇氨基酸比較，發(fā)現(xiàn)已經產生多位點突變，這可能會導致病毒抗原性發(fā)生較大改變。因此應該及時對我國流感H3N2亞型疫苗組分進行更新。

綜上所述，2014-2015商洛市流感監(jiān)測年度流感流行株以H3N2為主，且WHO推薦疫苗株組分匹配性已不是最佳，急需更新，其主要原因可能受環(huán)境因素及人群活動影響，與本地區(qū)經濟不發(fā)達，人群流感疫苗接種率普遍偏低，病毒抗原的不斷變異，病毒逃避免疫等機制相關。因此對流感抗原變異情況及時監(jiān)測分析，對預測流感流行情況、疫苗匹配性及篩選有重要意義和參考價值。

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