王根桃， 黃 松

(1.福建省腫瘤醫(yī)院口腔科, 福州 350014； 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院骨外科, 湖北 武漢 430077)

口腔癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，全球每年新增口腔癌患者約10萬人[1]。但是絕大多數(shù)口腔癌為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，惡性程度較高，治療主要以手術(shù)為主，放化療相結(jié)合為輔[2]。近年來，靶向藥物已成為研究的熱點(diǎn)，它不僅能夠抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且藥物的副作用也有一定程度的降低。例如易瑞沙已應(yīng)用于肺癌的治療并取得良好的治療效果。因此，對(duì)口腔鱗癌進(jìn)行深入研究，尋找更多潛在的靶點(diǎn)是十分必要的[3-4]。近年來研究表明，ERK-FAK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移、侵襲等多種生物學(xué)反應(yīng), 此通路的異?？赡苁悄[瘤發(fā)生的機(jī)制之一[5]。

黃芩素(baicalein, BAI)來源于中藥黃芩，具有多重藥理作用，例如抗炎、抗感染、抗腫瘤細(xì)胞增殖等作用。因其作用廣泛且具有高效低度的特點(diǎn)，所以我們檢測(cè)了黃芩素是否可以抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲。因此, 我們用不同濃度的黃芩素來處理口腔鱗癌細(xì)胞，用Western blot、PCR等方法檢測(cè)E-cadherin, Vimentin, 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular singnal-regulated kinase, ERK)和粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩素可能通過ERK-FAK信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲，為黃芩素更好地應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是其具體的分子機(jī)制還尚待研究。

1 材料與方法

1.1 試劑

人口腔鱗癌細(xì)胞株TCA8113購自 American Type Culture Collection( ATCC)。實(shí)驗(yàn)所用抗體購自 Santa Cruz Biotechnology公司。黃芩素購自南京廣潤生物制品有限公司。MEK抑制劑購自selleck公司。DMEM、胎牛血清、TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。CCK8試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、細(xì)胞培養(yǎng)及檢測(cè)指標(biāo)

本研究分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)4個(gè)組，每組重復(fù)3此。實(shí)驗(yàn)1：黃芩素用DMSO溶解，配成濃度為100 mmol/L的儲(chǔ)存液備用并稀釋成4個(gè)濃度：control, 20 μmol/L BAI, 40 μmol/L BAI, 80 μmol/L BAI；實(shí)驗(yàn)2： MEK抑制劑(U0126)用培養(yǎng)基溶解，其IC50等于0.33 nmol/L，實(shí)驗(yàn)處理因素為：control, 40 μmol/L BAI, MEK抑制劑，MEK抑制劑+40 μmol/L BAI。各組分別處理24 h和48 h。與80 μmol/L BAI處理組相比，對(duì)照組、MEK抑制劑處理組以及其他低濃度的BAI處理組用DMSO配平，保證各組DMSO濃度一致。用含有10% 的胎牛血清(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)培養(yǎng), 孵箱條件為37℃、 5% CO2。檢測(cè)指標(biāo)有細(xì)胞增殖情況，Vimentin和E-cadherin的mRNA以及蛋白水平，ERK, p-ERK, FAK, p-FAK的蛋白水平。

1.3 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率

在96孔板中配置100 ml的細(xì)胞懸液(約5×103cells/well)。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)8 h至貼壁。向培養(yǎng)板加入不同濃度的黃芩素。作用24和48 h后，向每孔加入10 ml CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 RNA提取及半定量PCR檢測(cè)mRNA水平

將細(xì)胞鋪于6孔板中(約5×104cells/well)，待細(xì)胞6～8 h貼壁后，加入不同濃度的黃芩素。24和48 h后，用TRIzol法提取，最后再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物順序: E-cadherin 上游：5’-ATTCGTATT- CTGCTGCTCTTG-3’, 下游：5’-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3’；Vimentin 上游：5’-CAGCCATGACCACCAGG-3’, 下游 5’-AAGGTCAAGACTGTCCAG-3； GAPDH 上游：5’-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3’, 下游：5’-AGGGGAGAATTCAGTGTGGTG-3’。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白水平

將細(xì)胞鋪于6孔板中(約5 x 104cells/well)，待細(xì)胞6～8 h貼壁后，加入不同的處理因素(control, 20 μmol/Lol/L BAI, 40 μmol/Lol/L BAI, 80 μmol/L BAI或者control, 40 μmol/L BAI, MEK抑制劑，MEK抑制劑+40 μmol/L BAI)。分別在24與48 h用常規(guī)的蛋白裂解法提取。蛋白經(jīng)過10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜以及抗體的孵育與洗滌。最后采用化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(ECL)檢測(cè), 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。蛋白條帶采用Image J(V1.8.0)軟件定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芩素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，與對(duì)照組相比，濃度梯度的黃芩素處理組的細(xì)胞增殖率逐漸降低，這說明黃芩素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且在48 h的作用明顯高于24 h的作用(圖1)。

2.2 黃芩素對(duì)細(xì)胞侵襲的影響

E-cadherin和Vimentin是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的兩個(gè)標(biāo)志性蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，濃度梯度的黃芩素能夠上調(diào)E-cadherin的水平，降低Vimentin的水平(圖 2A，2B)。

Fig.1The cells’ survival rate under different concentrations of baicalin(BAI) treatment(n=3)

**P<0.01vs0 μmol/L BAI group

Fig.2The effects of BAI on the expressions of E-cadherin and Vimentin(n=3)

A: The mRNA level change of E-cadherin and Vimentin; B: The protein level change of E-cadherin; C: The protein level change of Vimentin

*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L BAI group

2.3 黃芩素對(duì)腫瘤細(xì)胞中ERK-FAK信號(hào)通路的影響

ERK-FAK信號(hào)通路異常與口腔鱗癌密切相關(guān)。因此，我們用Western blot檢測(cè)藥物處理之后的ERK, p-ERK, FAK以及p-FAK的表達(dá)。結(jié)果顯示，黃芩素對(duì)總的ERK(圖3A)與FAK(圖3C)并沒有明顯的變化，但是可以明顯降低磷酸化的ERK(圖3B)與FAK(圖3D)蛋白水平。

Fig.3The effects of BAI on the expressions of ERK， p-ERK， FAK and p-FAK(n=3)

A: ERK protein level; B: p-ERK protein level; C: FAK protein level; D: p-FAK protein level

*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L BAI group

2.4 MEK抑制劑對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖遷移以及ERK-FAK信號(hào)通路的影響

Western blot分析結(jié)果顯示MEK抑制劑(U0126)能夠增強(qiáng)黃芩素的作用，上調(diào)E-cadherin(圖4A)的表達(dá)，下調(diào)Vimentin(圖4B)的表達(dá)，進(jìn)一步抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。與對(duì)照組相比， 黃芩素處理組p-ERK(圖4D)以及p-FAK(圖4F)的蛋白表達(dá)水平升高，但總的ERK(圖4C)以及FAK(圖4E)的蛋白水平并沒有明顯的變化。這提示著黃芩素發(fā)揮其增殖侵襲抑制作用可能與ERK-FAK信號(hào)通路相關(guān)。

Fig.4The effects of MEK inhibitor and BAI on the expressions of E-cadherin, Vimentin, ERK, p-ERK, FAK and p-FAK (n=3)

A: The level change of E-cadherin； B: The level change of Vimentin； C: The level change of ERK； D: The level change of p-ERK； E: The level change of FAK； F: The level change of p-FAK

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)節(jié)失控是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要因素之一[6]。由于腫瘤細(xì)胞具有侵襲轉(zhuǎn)移的特性，使得臨床上很難完全治愈各種腫瘤。對(duì)腫瘤患者進(jìn)行手術(shù)前誘導(dǎo)化療，由于局部血管破壞較少，血液供應(yīng)良好，因此有利于化療藥物更好地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞?？谇击[癌是一個(gè)日趨嚴(yán)重的世界范圍內(nèi)的問題；由于其治療的局限性，口腔鱗癌患者的生存率仍無明顯的改善。新輔助化療PF方案，即DDP和5-Fu的聯(lián)合應(yīng)用，被認(rèn)為是口腔鱗癌術(shù)前誘導(dǎo)化療的首選方案。但臨床上一些理學(xué)指標(biāo)難以測(cè)定，使得我們較難客觀評(píng)價(jià)其療效[7]而且化療藥物帶來的副作用大大降低患者的生活質(zhì)量。因此，尋找新的治療藥物或新的治療靶點(diǎn)迫在眉睫。

近年來，從天然藥物中尋找有效的成分現(xiàn)已成為治療腫瘤的熱點(diǎn)。黃芩素主要存在于黃芩，是黃芩根中的主要有效成分[8]。黃芩素具有廣泛的藥理作用。它不僅能夠改善腦血循環(huán)、增加腦血流量、降低腦血管阻力及抗血小板凝集，還能夠發(fā)揮抗炎、抗 HIV、清除自由基和抗氧化、抗菌、保護(hù)神經(jīng)元、抗過敏、抗糖尿病腎病等作用[9-11]。在臨床上，黃芩素主要用于腦血管病后癱瘓的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素還對(duì)肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞具有廣泛的預(yù)防和治療作用。黃芩素對(duì)A549細(xì)胞生長和增殖具有強(qiáng)大的抑制作用[12]。Miocinouic等的研究結(jié)果顯示, 黃芩素通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平顯著抑制前列腺癌DU-145瘤體的血管生成[13]。但是其具體的分子機(jī)制還不清楚。

信號(hào)通路異常是大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要的因素，常見的異常通路包括，BMP/Smad，TGF-β，PI3K/AKT，p53，mTOR等。研究表明，異常的ERK-FAK信號(hào)通路也涉及腫瘤發(fā)展的過程[5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)傳遞途徑起著極為重要的作用，控制著細(xì)胞多種生理過程。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族的一員，具有多種生理作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、死亡、增殖、分化和存活等。在許多人類的癌癥(如口腔癌、黑色素瘤 、乳腺癌等)中都可發(fā)現(xiàn)ERK的過度激活[14]。FAK為局部粘著斑激酶，是一種酪氨酸激酶，并且與ERK之間具有密切聯(lián)系。據(jù)研究表明，ERK-FAK信號(hào)不僅參與平滑肌、神經(jīng)元、糖尿病的調(diào)節(jié)[15-16]，它在腫瘤向惡性侵襲轉(zhuǎn)移演進(jìn)的過程中起著重要的作用[17]。王亞峰[18]等提出纖連蛋白可以通過激活FAK，從而促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖，但是并沒有把傳統(tǒng)中藥與口腔鱗癌的治療相結(jié)合。本研究采用Western blot等方法證實(shí)黃芩素可能通過ERK-FAK通路抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲。這些結(jié)果也為口腔鱗癌的治療以及中成藥的發(fā)展提供新的方案和基礎(chǔ)。