李曉娟，孫兆增，馮 帆，姜棋予，孫慧偉，李 潤，柴燕濤，侯 俊*，李瑞生*

(1.解放軍第302醫(yī)院臨床研究管理中心，北京 100039； 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071)

實驗動物遺傳背景的一致性和多樣性，是衡量實驗動物品質(zhì)的一個重要因素，因此在實驗動物的飼養(yǎng)與繁育中，發(fā)現(xiàn)和培育具有特殊生物學(xué)性能的動物品系是非常重要的[1]。本實驗室于2012年發(fā)現(xiàn)的BABL/c卷毛小鼠，通過五年多的近交培育現(xiàn)已完全成為一個遺傳穩(wěn)定的近交系突變卷毛小鼠品系[2]。微衛(wèi)星又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)，作為分子標記在實驗動物的遺傳質(zhì)量檢測和科學(xué)研究中已得到了廣泛地應(yīng)用[3-6]。本研究將高通量的熒光PCR技術(shù)應(yīng)用到小鼠微衛(wèi)星DNA遺傳檢測中，利用篩選出的38個微衛(wèi)星位點標記對BALB/c正常小鼠、突變卷毛小鼠和突變無毛小鼠等三個品系進行檢測分析，旨在了解BALB/c突變卷毛小鼠與正常近交系BALB/c小鼠的遺傳背景是否存在差異以及差異的程度，以期建立近交系BALB/c突變卷毛小鼠種質(zhì)資源的遺傳特性，為后期建系保種、品系培育以及科學(xué)研究提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取近交培育的SPF級BALB/c突變卷毛小鼠(來源解放軍第302醫(yī)院動物實驗室)、BALB/c正常小鼠和突變無毛小鼠(來源軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[SCXK(軍)2012-0004])各10只，雌雄各半，體重18～20 g。本實驗室使用許可證[SYXK(軍)2012-0010]，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA樣本制備

取小鼠尾巴剪成米粒大小，加入DNA提取液和蛋白酶K過夜消化，采用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，最終稀釋成50～100 ng/μL作為DNA模板[7]。

1.2.2 微衛(wèi)星位點的選擇及熒光標記

本研究選D1Mit365、D2Mit15、D2Mit30、D3Mit29、D3Mit51、D4Mit235、D5Mit48、D6Mit8、D6Mit15、D6Mit102、D7Mit12、D7Mit281、D8Mit14、D8Mit33、D8Mit113、D9Mit21、D9Mit23、D10Mit12、D10Mit180、D11Mit4、D11Mit128、D12Mit7、D12Nds11、D12Mit147、D13Mit3、D14Mit3、D14Mit102、 D15Mit5、D15Mit15、D16Mit9、D16Mit145、D17Mit36、D17Nds3、D18Mit9、D18Mit19、D18Mit94、D19Mit3和DXMit16等38個微衛(wèi)星位點參考MMDBJ 數(shù)據(jù)庫(Mouse Microsatellite Data Base of Japan) 及文獻[8]，以在不同小鼠品系間多態(tài)信息豐富的位點為主，均勻分布于19條常染色體和X染色體上，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，各微衛(wèi)星位點上游PCR引物的5’端均用FAM熒光染料進行標記。

1.2.3 熒光引物PCR擴增

PCR反應(yīng)體系為10 μL: 2×Type-it Multiplex PCR Master Mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL，模板DNA 0.5 μL，RNase-free water補足10 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；退火溫度58℃和53℃，30 s；72℃延伸30 s；20個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min；擴增產(chǎn)物4℃保存。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物檢測及STR掃描

四種PCR產(chǎn)物各取0.3 μL、分子量內(nèi)標0.5 μL和去離子甲酰胺9.5 μL混合加入PCR板，95℃變性5 min，4℃冷卻后離心，1× buffer緩沖液上機檢測。將熒光標記的PCR產(chǎn)物通過ABI3730 測序儀的毛細管凝膠電泳進行掃描檢測，用Genemarker 2.2.0 軟件收集測序儀毛細管凝膠電泳的數(shù)據(jù)，用Gene Mapper軟件分析各位點的片段大小。

2 結(jié)果

2.1 三個品系小鼠間STR掃描相同微衛(wèi)星位點結(jié)果分析

對三個品系小鼠的38個微衛(wèi)星位點STR掃描檢測結(jié)果顯示：BALB/c突變卷毛小鼠與正常小鼠間有27個位點的DNA片斷完全相同，且突變卷毛雌雄鼠間也完全相同，如D2Mit30位點(見圖1)，與無毛突變鼠間有26個位點相同；而無毛突變鼠與正常小鼠間有30個位點相同(見表1)。

2.2 三個品系小鼠間STR掃描不同微衛(wèi)星位點結(jié)果分析

STR掃描檢測結(jié)果顯示：BALB/c突變卷毛小鼠與正常小鼠間有11個位點存在差異，而突變卷毛雌雄鼠間完全相同，如D6Mit15位點(見圖2)，與無毛小鼠間有12個位點存在差異，且卷毛鼠與其他兩個品系間有5個位點交叉存在差異；而正常BABL/c鼠與無毛鼠間有8個位點存在差異(見表1)。

2.3 三個品系小鼠間差異性位點的數(shù)量及遺傳突變率的分析

38個位點中BALB/c突變卷毛鼠與正常小鼠間有11個位點發(fā)生突變，其突變率為28.9%，與無毛小鼠間有12個位點存在差異，其突變率為31.6%；而BALB/c突變無毛小鼠與正常鼠間有8個位點發(fā)生突變，其突變率為21.1%。結(jié)果表明BALB/c突變卷毛鼠的突變率明顯高于無毛小鼠(見表2)。

注：A：BALB/c正常鼠(♂)；B: BALB/c無毛鼠(♂)；C～D: BALB/c卷毛鼠(♂)；E～F: BALB/c卷毛鼠(♀)；A～F波峰值全部相同；縱坐標為波峰高度，橫坐標為掃描時間。圖1 D2Mit30位點的微衛(wèi)星掃描波形Note.A: BALB/c mouse(♂). B: Mutant hairless mouse (♂). C-D: Mutant curly mice (♂). E-F: Mutant curly mice (♀). The peaks are all the same in A-F．Y-axis is the peak height, X-axis is the scan time．Fig.1 The waveforms of loci D2Mit30 in STR scanning

注：A：BALB/c正常鼠(♂)；B: BALB/c無毛鼠(♂)；C～D: BALB/c卷毛鼠(♂)；E～F: BALB/c卷毛鼠(♀)；A～B與C～F的波峰值不同；縱坐標為波峰高度，橫坐標為掃描時間。圖2 D6Mit15位點的微衛(wèi)星掃描波形Note.A: BALB/c mouse (♂). B: Mutant hairless mouse (♂). C-D: Mutant curly mice (♂). E-F: Mutant curly mice (♀).The peaks in A-B are different from that in C-F．Y-axis is the peak height. X-axis is the scan time．Fig.2 The waveforms of loci D6Mit15 in STR scanning

序號No.位點Loci正常鼠♂Normal mouse♂卷毛鼠♂Curlymouse♂卷毛鼠♂Curlymouse♂卷毛鼠♂Curlymouse♂卷毛鼠♀Curlymouse♀卷毛鼠♀Curlymouse♀卷毛鼠♀Curlymouse♀無毛鼠♀Hairless mouse♀正常鼠♀Normal mouse♀1D2Mit151401401401401401401401401402D2Mit301301301301301301301301301303D3Mit512562562562562562562562562564D4Mit2359393939393939393935D6Mit81871871871871871871871871876D6Mit1021321321321321321321321321327D7Mit12198/200198/200198/200198/200198/200198/200198/200198/200198/2008D7Mit2811371371371371371371371371379D8Mit3322222222222222222222222222210D8Mit11315915915915915915915915915911D9Mit2320520520520520520520520520512D10Mit1223823823823823823823823823813D11Mit424624624624624624624624624614D12Mit7119/121119/121119/121119/121119/121119/121119/121119/121119/12115D14Mit10213313313313313313313313313316D14Mit322822822822822822822822822817D15Mit596969696969696969618D16Mit145115/129115/129115/129115/129115/129115/129115/129115/129115/12919D16Mit912412412412412412412412412420D17Mit3611111111111111111111111111121D17Nds312312312312312312312312312322D18Mit915515515515515515515515515523D19Mit319819819819819819819819819824DXMit1693939393939393939325D9Mit2119219219219219219219221419226D12Nds1117817817817817817817817617827D15Mit1515615615615615615615614615628D1Mit3651069494949494949410629D11Mit12812512712712712712712712712530D3Mit2920314514514514514514514720331D6Mit1519415215215215215215219419432D8Mit1416313913913913913913916316333D10Mit18014812812812812812812814814834D12Mit14718914914914914914914918918935D13Mit318916516516516516516518918936D18Mit1915415215215215215215215815437D18Mit9414012412412412412412414014038D5Mit48194202202202202202202226194

表2 38個微衛(wèi)星位點在三個小鼠種群中的突變率

3 討論

微衛(wèi)星DNA標記主要具有分布廣、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、數(shù)量多和片段短容易擴增等優(yōu)勢，而被作為一種非常重要、成熟的遺傳工具廣泛應(yīng)用于各類實驗動物的遺傳檢測和科學(xué)研究中[9]。小鼠基因組圖譜已包含了7377個微衛(wèi)星DNA，其中有6580個具有顯著的多態(tài)性[10]，能夠更全面地反映出基因組的遺傳特性及變異情況。目前應(yīng)用微衛(wèi)星標記方法不但可以進行純合位點的判定，而且還能對基因位點的變異情況進行統(tǒng)計分析[11]。DNA全自動測序儀的毛細管凝膠電泳技術(shù)是近年來快速發(fā)展起來的一種新技術(shù)，該技術(shù)將熒光標記的PCR產(chǎn)物和標準分子量樣品(內(nèi)參) 在同一毛細管中進行電泳，DNA分析儀將結(jié)果自動記錄在計算機上，利用片段分析軟件進行圖像收集和分析，而更精確地計算出微衛(wèi)星位點的等位基因片段大小，是遺傳檢測研究的主要發(fā)展方向[12]。

由于BALB/c突變卷毛小鼠和無毛小鼠均是由正常BALB/c小鼠突變產(chǎn)生的[13]，因此本研究結(jié)合熒光PCR檢測方法和毛細管凝膠電泳法應(yīng)用到微衛(wèi)星的分型檢測中，將篩選的38個微衛(wèi)星位點對正常BALB/c小鼠、BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c突變無毛小鼠這三個群體的遺傳背景進行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)38個微衛(wèi)星位點在BALB/c突變卷毛小鼠和正常小鼠之間有27個微衛(wèi)星位點是完全相同的，有11個位點存在差異，其突變率為28.9%(11/38)接近三分之一，顯示其突變率較高。而BABL/c無毛小鼠與正常小鼠之間有30個位點相同，8個位點存在差異，其突變率為21.1%(8/38)，相比發(fā)現(xiàn)突變卷毛小鼠其突變率明顯高于無毛小鼠。而BABL/c突變卷毛小鼠與無毛小鼠之間也有12個位點存在差異，證明了卷毛小鼠突變與無毛小鼠突變是兩個完全不同的突變系。突變無毛小鼠的生理生化指標、染色體定位以及皮膚結(jié)構(gòu)的差異都已得到了證實[13]。實驗前期本實驗室也證實了BABL/c突變卷毛小鼠的血液生化指標、皮膚組織結(jié)構(gòu)以及生長發(fā)育指標均與正常小鼠存在差異[14-15]，從而說明了BALB/c突變卷毛小鼠是一個非常寶貴難得的突變系小鼠。

總之，本實驗應(yīng)用38個微衛(wèi)星位點結(jié)合熒光PCR微衛(wèi)星標記檢測技術(shù)，對BALB/c突變卷毛小鼠的變異情況進行遺傳檢測分析，旨在發(fā)現(xiàn)BALB/c突變卷毛小鼠與正常小鼠之間存在的差異以及差異的程度，為今后進一步研究BALB/c突變卷毛小鼠的遺傳特性和未來開發(fā)應(yīng)用該突變系小鼠模型提供可靠的理論參考。

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