何宇，張安仁，孫年怡，王文春，王志強(qiáng)，田麗君，鄒文晨，張志強(qiáng)

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院康復(fù)中心，遼寧沈陽(yáng)市110134；2.中國(guó)人民解放軍成都總醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川成都市610083

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，全球范圍內(nèi)脊髓損傷的發(fā)生率為每百萬(wàn)人中236～4187例[1]。我國(guó)有近200萬(wàn)脊髓損傷患者，并且每年增長(zhǎng)約5萬(wàn)人[2]。如何有效治療脊髓損傷患者，使其最大程度獲得功能的恢復(fù)和生活質(zhì)量的改善，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。飲食干預(yù)療法可能是目前脊髓損傷多種潛在有效治療方法中臨床可行性、安全性及經(jīng)濟(jì)效率最好的方法之一[3]。

近十多年來(lái)，一種新飲食限制方法間斷性禁食(intermittent fasting,IF)顯示出有益健康的作用，并逐漸被人們接受。IF是采用常規(guī)飲食和禁食不斷交換來(lái)防治某些疾病的飲食限制方案。IF并不局限于單一的方式，多采用隔日限食(every-other-day fasting,EODF)，即正常飲食與禁食各24 h，交替進(jìn)行，禁食期間飲水不受任何限制[4]。IF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生有益作用的相關(guān)細(xì)胞機(jī)制包括減少氧化損傷分子的積累、細(xì)胞生物能量學(xué)改善、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)增強(qiáng)以及炎性反應(yīng)減輕等[5]。有基礎(chǔ)研究證實(shí)，IF可通過(guò)減輕腦卒中、腦外傷動(dòng)物模型的炎性反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，有助于改善神經(jīng)功能缺損[4,6-10]。本實(shí)驗(yàn)使用醫(yī)用腦血管臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾建立大鼠鉗夾脊髓損傷模型，觀察EODF對(duì)脊髓損傷大鼠脊髓組織病理變化和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響，及其對(duì)脊髓損傷急性期腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)水平的影響，為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雌性Sprague-Dawley成年大鼠，體質(zhì)量280～300 g，共216只，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(川)2015-030，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。術(shù)前、術(shù)后分籠飼養(yǎng)于安靜、通風(fēng)、清潔的普通級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的飼養(yǎng)及處置遵循動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑

10%水合氯醛、無(wú)水乙醇、蒸餾水、二甲苯、中性樹(shù)膠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。4%多聚甲醛、甲苯胺藍(lán)染色試劑：武漢谷歌生物科技有限公司。

大鼠IL-10 ELISA試劑盒：杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。大鼠TNF-αELISA試劑盒：美國(guó)昂飛公司。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

Yasargil牌FT228T鈦合金迷你型腦動(dòng)脈瘤夾(標(biāo)定力70 g)、施夾鉗：德國(guó)貝朗醫(yī)療有限公司。手術(shù)顯微鏡：上海安信光學(xué)儀器制造有限公司。光學(xué)顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠。SE-93自動(dòng)蒸餾水器：上海亞榮生化儀器廠。組織包埋機(jī)：美國(guó)熱電公司。切片機(jī)：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。酶標(biāo)儀：芬蘭雷勃公司。

其他：持針器、血管鉗、蚊式鉗、眼科剪、眼科鑷、玻璃分針等常規(guī)手術(shù)器械，采血針、采血管、移液槍、TIP頭、EP試管、微波爐、染色缸、染色架、濕盒、載玻片、蓋玻片、醫(yī)用縫合針等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與干預(yù)措施

1.2.1 實(shí)驗(yàn)1

將36只大鼠編號(hào)1～36，利用EXCEL建立一列編號(hào)1～36，在每個(gè)數(shù)字之后生成一個(gè)隨機(jī)數(shù)“=RAND()”，根據(jù)所生成隨機(jī)數(shù)的值進(jìn)行降序排列，依次分至假手術(shù)組、假手術(shù)+EODF組、脊髓損傷組和脊髓損傷+EODF組，每組9只。兩個(gè)脊髓損傷組接受脊髓損傷手術(shù)，兩個(gè)假手術(shù)組僅接受椎板切除術(shù)。假手術(shù)+EODF組和脊髓損傷+EODF組術(shù)后立即開(kāi)始禁食24 h(僅供飲水，下同)，之后給予24 h常規(guī)食物，然后再禁食24 h，如此反復(fù)直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)2

另外180只大鼠隨機(jī)分配方法和分組同實(shí)驗(yàn)1，每組45只，各組又分為術(shù)后6 h、12 h、1 d、3 d、7 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各9只。干預(yù)措施同實(shí)驗(yàn)1。

1.3 造模

采用醫(yī)用腦血管臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾鉗夾脊髓的方法[11-14]建立大鼠脊髓鉗夾損傷模型。大鼠稱重，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉生效后，將大鼠俯臥固定于自制手術(shù)臺(tái)上，確定T10位置。背部局部剪毛備皮，常規(guī)消毒輔巾。以T10棘突為中心點(diǎn)，后正中切口約3 cm，逐層切開(kāi)皮膚、皮下筋膜組織以及椎旁肌，鈍性分離椎旁肌肉至關(guān)節(jié)突并向兩側(cè)牽開(kāi)，充分暴露T9～T11棘突和雙側(cè)椎板。用蚊式鉗小心咬除T10棘突、椎板及部分T9、T11棘突和椎板，清晰暴露脊髓背側(cè)硬膜。用持針器夾住三角針，將三角針的鈍性端從硬膜與其前方的椎體之間穿至對(duì)側(cè)，從而在兩者之間形成一通道，以容動(dòng)脈瘤夾通過(guò)。用施夾鉗夾持住動(dòng)脈瘤夾，張開(kāi)瘤夾后從T10處經(jīng)通道穿至對(duì)側(cè)，確保動(dòng)脈瘤夾完全橫跨過(guò)脊髓，然后釋放瘤夾，緊緊完全夾住脊髓。30 s后，撤去瘤夾，可見(jiàn)鉗夾處硬膜有一條明顯的血腫印記。生理鹽水沖洗傷口及清除殘留血液，止血后常規(guī)分層縫合傷口。假手術(shù)組除不進(jìn)行夾脊髓外其余操作同脊髓損傷組。術(shù)后大鼠置于溫暖環(huán)境直至完全蘇醒。

術(shù)前對(duì)每只大鼠腹腔注射生理鹽水5 ml，增加循環(huán)血量，預(yù)防創(chuàng)傷性失血所致休克而引起的死亡。術(shù)后3 d常規(guī)肌注青霉素20萬(wàn)IU/d。術(shù)后保持墊料清潔干燥，每天2次(8時(shí)和20時(shí))膀胱擠壓協(xié)助排尿，直至大鼠無(wú)血尿并恢復(fù)自主排尿。

1.4 觀測(cè)指標(biāo)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)1

1.4.1.1 運(yùn)動(dòng)功能

應(yīng)用Ohio State University 1995年發(fā)布的經(jīng)典BBB行為評(píng)分法[15](Basso-Beattie-Bresnahan score,BBB score)進(jìn)行行為學(xué)觀察。于術(shù)前1 d及術(shù)后1 d、術(shù)后第2、4、6、8、10、12周對(duì)各組進(jìn)行評(píng)分。由熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的2名非本組實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立進(jìn)行觀察記錄，觀察人員對(duì)分組不知情。每次觀察4 min，左右兩側(cè)肢體分別評(píng)分，取2名觀察者的平均值作為每次記錄值。

1.4.1.2 甲苯胺藍(lán)染色

術(shù)后第12周，過(guò)量藥物麻醉處死大鼠，經(jīng)心臟灌流取脊髓組織。截取以損傷部位為中心的脊髓組織長(zhǎng)10 mm，樣本置于4%多聚甲醛固定過(guò)夜后，石蠟包埋，連續(xù)切片，行甲苯胺藍(lán)染色，高倍鏡下觀察脊髓結(jié)構(gòu)變化。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)2

在術(shù)后6 h、12 h、1 d、3 d、7 d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采集各組大鼠血清標(biāo)本，采用ELISA檢測(cè)血清TNF-α、IL-10水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量變量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。正態(tài)分布資料以(xˉ±s)表示，組間方差齊同條件下，實(shí)驗(yàn)分組均數(shù)差異比較采用兩因素方差分析，并采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩組間比較；組間方差不齊條件下，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分

術(shù)前各組大鼠BBB評(píng)分均為21分。脊髓損傷組和脊髓損傷+EODF組BBB評(píng)分在術(shù)后1 d降至最低(P＜0.05)，隨時(shí)間逐漸增加，術(shù)后第8、10、12周，脊髓損傷+EODF組優(yōu)于脊髓損傷組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 脊髓組織病理變化

術(shù)后第12周，假手術(shù)組和假手術(shù)+EODF組組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯病理改變。脊髓蝴蝶型灰質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)完整清晰；神經(jīng)元胞漿內(nèi)見(jiàn)琥珀斑狀尼氏體；白質(zhì)區(qū)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)清晰。見(jiàn)圖1、圖2。

脊髓損傷組見(jiàn)脊髓蝴蝶型灰質(zhì)區(qū)損傷嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)不清，大面積壞死脫落，神經(jīng)細(xì)胞大量減少，結(jié)締組織增生并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；部分神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，胞漿內(nèi)尼氏體結(jié)構(gòu)不清；灰質(zhì)區(qū)外白質(zhì)區(qū)部分神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不清。見(jiàn)圖3。

脊髓損傷+EODF組可見(jiàn)脊髓蝴蝶型灰質(zhì)區(qū)損傷嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)不清，局灶性壞死脫落，神經(jīng)細(xì)胞大量減少，結(jié)締組織增生并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；存活神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，胞漿內(nèi)清晰可見(jiàn)著色均勻琥珀斑狀尼氏體；灰質(zhì)區(qū)外白質(zhì)區(qū)神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不清，排列紊亂并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖4。

2.3 血清TNF-α水平

與假手術(shù)組相比，脊髓損傷組術(shù)后12 h血清TNF-α水平升高(P＜0.05)，呈先升后降趨勢(shì)，7 d恢復(fù)。術(shù)后1 d，脊髓損傷+EODF組血清TNF-α表達(dá)水平低于脊髓損傷組(P＜0.05)；術(shù)后1 d、7 d，假手術(shù)+EODF組TNF-α表達(dá)水平低于假手術(shù)組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 血清IL-10水平

與假手術(shù)組相比，脊髓損傷組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清IL-10水平均升高(P＜0.05)。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，脊髓損傷+EODF組與脊髓損傷組間血清IL-10水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，假手術(shù)+EODF組和假手術(shù)組間血清IL-10水平無(wú)明顯差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 術(shù)后12周假手術(shù)組脊髓組織病理形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色)

圖2 術(shù)后12周假手術(shù)+EODF組脊髓組織病理形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色)

圖3 術(shù)后12周脊髓損傷組脊髓組織病理形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色)

圖4 術(shù)后12周脊髓損傷+EODF組脊髓組織病理形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色)

表1 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)各組BBB評(píng)分比較

表2 各組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α水平(pg/ml)

表3 各組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血清IL-10水平(pg/ml)

3 討論

脊髓損傷的病理生理過(guò)程可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)階段。原發(fā)性損傷是暴力創(chuàng)傷產(chǎn)生的瞬間脊髓組織受到的直接破壞，在這個(gè)過(guò)程中，脊髓的神經(jīng)組織會(huì)立即遭受到不可逆轉(zhuǎn)的永久性傷害，出現(xiàn)大量神經(jīng)細(xì)胞死亡[16-17]；繼發(fā)性損傷是由原發(fā)性損傷引起的一系列細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)反應(yīng)，研究表明[18-22]，其主要因素有出血、缺血、神經(jīng)遞質(zhì)的累積、離子通道的開(kāi)放、興奮性毒性損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化、自由基的產(chǎn)生、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等。繼發(fā)性損傷可出現(xiàn)于受傷最初的數(shù)分鐘內(nèi)，持續(xù)數(shù)小時(shí)到數(shù)天，甚至?xí)^(guò)數(shù)周到數(shù)月，這些一系列反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步引起組織的破壞和損傷區(qū)域的擴(kuò)大[23]。繼發(fā)性損傷具有可逆性，在脊髓損傷早期采取正確及時(shí)的干預(yù)，可以保護(hù)殘存的脊髓組織，減輕持續(xù)的神經(jīng)損傷，可直接影響脊髓損傷患者的最終康復(fù)效果。因此，在脊髓損傷早期，以繼發(fā)性損傷為目標(biāo)、旨在減少病理后果的神經(jīng)保護(hù)策略是脊髓損傷治療的關(guān)鍵。

神經(jīng)損傷后，改變飲食或代謝的治療方法與其他療法相比可能是侵害性最小的。這類治療方法近年來(lái)才被應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性脊髓損傷。有研究者將EODF用于治療頸段及胸段急性脊髓打擊傷大鼠，發(fā)現(xiàn)EODF具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，并能有效促進(jìn)損傷肢體的功能恢復(fù)[24-27]。本實(shí)驗(yàn)將EODF應(yīng)用于T10節(jié)段大鼠鉗夾型脊髓損傷模型，通過(guò)12周的行為學(xué)觀察和組織學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EODF能有效促進(jìn)鉗夾型脊髓損傷模型大鼠損傷肢體的功能恢復(fù)，具有神經(jīng)保護(hù)作用

TNF-α是一種分子量為17 kDa的多肽，主要由活化的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。它處于炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心，被稱為促炎性細(xì)胞因子(proinflammatory cytokines)，是許多炎癥反應(yīng)過(guò)程的積極參與者?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后，患者體內(nèi)TNF-α的表達(dá)水平快速上調(diào)，并與受傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，脊髓損傷有關(guān)研究結(jié)果一致[18,28-33]。

IL-10是一種強(qiáng)力的抗炎性細(xì)胞因子，在炎性疾病的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和人體試驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)其能成功地減輕炎癥并改善功能預(yù)后[34-35]。在脊髓損傷急性期，IL-10可通過(guò)抑制炎性反應(yīng)達(dá)到保護(hù)神經(jīng)功能的作用[36]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后血清TNF-α水平顯著升高，呈先升后降趨勢(shì)；血清IL-10水平顯著升高，說(shuō)明脊髓損傷同時(shí)啟動(dòng)了促炎性和抗炎性細(xì)胞因子的分泌[18]，與前人[37-38]的研究一致。

EODF后，脊髓損傷急性期血清TNF-α上升被抑制，IL-10并未顯著下降，提示EODF對(duì)脊髓損傷后急性期炎性反應(yīng)有一定抑制作用。

綜上所述，長(zhǎng)期EODF可促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能障礙的恢復(fù)，減輕脊髓損傷后的病理?yè)p害程度，對(duì)脊髓損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。EODF對(duì)脊髓損傷急性期炎性反應(yīng)的抑制作用，可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的基礎(chǔ)。

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