欒會(huì)芹，谷慧茹，閆和平，張瑩瑩，樊瑜波

1.國家康復(fù)輔具研究中心，北京市100176；2.北京市老年功能障礙康復(fù)輔助技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100176；3.民政部康復(fù)輔具分析評定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100176；4.康復(fù)輔具評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100176

頸托屬于輔具產(chǎn)品，是頸椎病輔助治療器具，可應(yīng)用于各種頸椎問題的輔助治療中。頸托能制動(dòng)和保護(hù)頸椎，減輕椎間關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性反應(yīng)，有利于組織水腫的消退和鞏固，防止復(fù)發(fā)。醫(yī)院常利用頸托輔助治療頸源性高血壓、椎動(dòng)脈型頸椎病、顱腦損傷患者及頭頸部手術(shù)患者[1-3]。隨著頸椎問題低齡化，日常生活中越來越多人需要頸托來輔助治療[4-5]。隨著使用人群及數(shù)量增加，市售頸托品牌也隨之增多，產(chǎn)品良莠不齊。頸托大多由高分子泡沫塑料熱性材料制成，在佩戴過程中，皮膚與材料形成臨界接觸面，界面環(huán)境對材料的腐蝕、降解、磨損等都會(huì)影響材料中物質(zhì)的釋放。當(dāng)材料中有毒性物質(zhì)滲出時(shí)，將會(huì)對皮膚表面及皮下組織等產(chǎn)生不良影響，長時(shí)間使用可能會(huì)對使用者造成二次傷害。因此頸托不僅需要有良好的理化性能，更需要有良好的生物相容性。2012年英國標(biāo)準(zhǔn)(British standard,BSEN 12182:2012)提出，與人體接觸的材料應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)生物相容性評估；要求輔助器具的設(shè)計(jì)和制造應(yīng)假定物質(zhì)會(huì)從產(chǎn)品中泄漏出來，并以此假設(shè)將風(fēng)險(xiǎn)降至最低；標(biāo)準(zhǔn)要求特別注意致癌物質(zhì)、致突變物質(zhì)、生殖毒性物質(zhì)以及其他高度關(guān)注物質(zhì)。

目前我國沒有對頸托等接觸皮膚輔具進(jìn)行生物安全性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。在醫(yī)療器械生物安全評價(jià)體系中，細(xì)胞毒性試驗(yàn)是一項(xiàng)重要的評價(jià)指標(biāo)[8]。隨著人們對輔具產(chǎn)品質(zhì)量的要求越來越高[9-11]，保證頸托產(chǎn)品的生物安全性問題已越來越受到國家的重視。根據(jù)樣品的特性，本實(shí)驗(yàn)采用顯微鏡觀察法及浸提液法，檢測頸托浸提液接觸L929細(xì)胞后的體外細(xì)胞毒性[12-13]，調(diào)查目前國內(nèi)市售頸托的細(xì)胞毒性現(xiàn)狀，以期為今后能更好地評價(jià)頸托的生物相容性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

頸托為市售，分別購于4個(gè)廠家。

1.1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：美國GIBCO公司。噻唑藍(lán)(Thiazole blue,MTT)、10%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(陽性對照)：美國SIGMA公司。高密度聚乙烯(陰性對照)：中國ALFA AESAR公司。浸提介質(zhì)為含10%血清細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.1.2 主要儀器

凈化工作臺、恒溫水浴箱：常州國華電氣有限公司。生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱：美國THERMO公司。倒置顯微鏡：日本NIKON公司。酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司。96孔板：美國CORNING公司。

1.2 方法

參照GB/T 16886.5-2003[14]和GB/T 16175-2008[15]體外細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)原則，采用顯微鏡觀察與MTT比色法，在小鼠成纖維細(xì)胞(L929株)上對4種不同品牌頸托細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測。

1.2.1 樣品浸提液制備[16]

頸托分別按每0.1 g樣品加1 ml浸提介質(zhì)及0.2 g樣品加1 ml浸提介質(zhì)兩個(gè)濃度，陰性對照按每0.2 g高密度聚乙烯加1 ml浸提介質(zhì)，置(37±1)℃，浸提24 h?？瞻讓φ詹捎?0%血清細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照采用10%二甲基亞砜，均與測試樣品同條件下制備。

1.2.2 顯微鏡觀察

試驗(yàn)設(shè)空白對照組、陰性對照組、陽性對照組、頸托材料組(0.1 g/ml、0.2 g/ml)。將1×104/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸液100 μl，每組6孔。置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，分別加入空白對照、陰性對照、陽性對照、頸托材料(0.1 g/ml、0.2 g/ml)浸提液，于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h，之后置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT比色試驗(yàn)

重復(fù)上述步驟至分別于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h，之后棄去培養(yǎng)基，加入5 g/L的MTT 20μl，37℃孵育4 h后，棄去上清，加入DMSO 150μl，室溫放置酶標(biāo)儀震蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長處，測定吸光度(optical density,OD)值。計(jì)算細(xì)胞相對增值率(relative growth rate,RGR)，RGR=實(shí)驗(yàn)組OD均值/空白對照組OD均值×100%。根據(jù)RGR值判斷細(xì)胞毒性反應(yīng)的級別[15]。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡觀察試驗(yàn)

各浸提液與細(xì)胞接觸培養(yǎng)72 h后，0.1 g/ml浸提濃度時(shí)，頸托D出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，死亡較多；0.2 g/ml浸提濃度時(shí)，頸托A與頸托D均出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，死亡較多。頸托B與頸托C在0.1 g/ml與0.2 g/ml兩個(gè)浸提濃度時(shí)，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞密度較空白對照組小。陰性對照組細(xì)胞形態(tài)完整，貼壁緊密，與空白對照細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。陽性對照組超過50%細(xì)胞形態(tài)成圓形，細(xì)胞死亡較多。

2.2 MTT比色試驗(yàn)

陰性對照細(xì)胞毒性為0級，陽性對照組細(xì)胞毒性為4級，對照試驗(yàn)系統(tǒng)成立，細(xì)胞毒性反應(yīng)分級見表1[15]。

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級

浸提液濃度為0.1 g/ml時(shí)，頸托D的RGR為48.3%，樣品細(xì)胞毒性為3級，具有中度細(xì)胞毒性；頸托A的RGR為67.2%，樣品細(xì)胞毒性反應(yīng)為2級，具有輕度細(xì)胞毒性；頸托B與頸托C的RGR為81%～99%，樣品細(xì)胞毒性為1級，細(xì)胞毒性反應(yīng)極輕微。

浸提液濃度為0.2 g/ml時(shí)，頸托A的RGR為14.7%，具有重度細(xì)胞毒性；頸托D的RGR為28.7%，為重度細(xì)胞毒性；頸托B與頸托C的細(xì)胞毒性為2級，具有輕度細(xì)胞毒性。見表2。

3 討論

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)具有通用性，已廣泛應(yīng)用于各種醫(yī)療器械及其材料的評價(jià)。試驗(yàn)分為三類：浸提液試驗(yàn)、直接接觸法試驗(yàn)和間接接觸法試驗(yàn)[17-19]。根據(jù)評價(jià)樣品的性質(zhì)及使用特性等選擇試驗(yàn)中的一類或幾類[20-22]。

頸托在使用過程中直接與人體皮膚接觸，因此最能反映人體使用情況的是直接接觸法。但直接接觸法對材料的要求較高，適用材料范圍有限。因頸托材料密度較小而易漂浮在培養(yǎng)基中，難以與細(xì)胞直接接觸，故本試驗(yàn)未選用此法。

瓊脂覆蓋法是間接接觸法的一種，研究發(fā)現(xiàn)受溶出物在瓊脂擴(kuò)散程度的影響，當(dāng)溶出物分子量小，易溶于水時(shí)，其敏感性高，反之則低[22]。在結(jié)果判定時(shí)，褪色區(qū)域的大小及溶解細(xì)胞的比例都是通過實(shí)驗(yàn)者觀察得到的，受一定主觀影響[23]。

浸提液試驗(yàn)包括顯微鏡觀察法和MTT比色法，其原理是使實(shí)驗(yàn)樣品的浸提液直接接觸受試哺乳動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過對細(xì)胞增殖或抑制情況的測試，評價(jià)實(shí)驗(yàn)樣品對細(xì)胞的體外毒性作用[24-25]。浸提液試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)是浸提液可以與細(xì)胞廣泛接觸，對于分析檢測樣品中可溶出物及其濃度對細(xì)胞的影響比較敏感，但不能用于檢測難溶于浸提介質(zhì)的物質(zhì)。MTT用于定量評價(jià)細(xì)胞毒性。比色法的原理是黃綠色的MTT被哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體酶降解形成藍(lán)紫色的物質(zhì)[26]，DMSO可將其溶解，酶標(biāo)儀測定其濃度，根據(jù)OD定量測定細(xì)胞的存活。OD值較大，則表示細(xì)胞存活率較高，材料的細(xì)胞毒性較小。

從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)可知，細(xì)胞毒性試驗(yàn)基本上是各種產(chǎn)品材料均選擇的試驗(yàn)，其特點(diǎn)是試驗(yàn)周期短，費(fèi)用低，靈敏度較高。開展細(xì)胞毒性安全性篩查可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。本次浸提液濃度為0.1 g/ml和0.2 g/ml。MTT比色法檢測時(shí)，頸托D在0.1 g/ml和0.2 g/ml浸提液的細(xì)胞毒性反應(yīng)分別為3級與4級，為中度與重度細(xì)胞毒性。頸托A在0.1 g/ml和0.2 g/ml浸提液的細(xì)胞毒性分別為2級與4級，為輕度及重度細(xì)胞毒性。以上結(jié)果說明頸托A與頸托D均有較高的細(xì)胞毒性，在長期佩戴過程中可能會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生不利影響。頸托B與頸托C在這兩個(gè)濃度時(shí)細(xì)胞毒性均較低，相對比較安全?？赡苡捎谒妙i托材料本身對細(xì)胞有一定的毒性作用，或生產(chǎn)工藝不同，其產(chǎn)品中含有的添加成分不同等因素導(dǎo)致或加重細(xì)胞毒性反應(yīng)。雖然本次試驗(yàn)研究中樣本量少，但4個(gè)廠家樣品中有兩家的細(xì)胞毒性較高，已經(jīng)反映出問題的嚴(yán)重性，應(yīng)當(dāng)引起輔具界重視。

表2 MTT比色法各組測定結(jié)果

頸托在常見頸椎問題中使用率較高，因此有必要對其生產(chǎn)原材料及生產(chǎn)工藝等環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)及管控，以減少其細(xì)胞毒性，減少對使用者的二次傷害。本試驗(yàn)采用顯微鏡觀察法和MTT比色法，對4個(gè)品牌頸托進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測，初探適合頸托的試驗(yàn)方法，考查了國內(nèi)部分市售頸托的體外細(xì)胞毒性現(xiàn)狀，為進(jìn)一步完善該產(chǎn)品的生物安全評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)積累了數(shù)據(jù)。此次樣本較少，今后研究我們會(huì)加大樣本量，做更深入更廣泛的研究。今后還需針對具體的材料，選擇合適評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和方法進(jìn)行探索和研究。此外，也需要生產(chǎn)廠家引起重視，在高分子泡沫原材料選擇及生產(chǎn)工藝等環(huán)節(jié)進(jìn)行改良，最大程度減少有害物質(zhì)釋放風(fēng)險(xiǎn)，保證產(chǎn)品生物安全性，降低對使用者的危害。

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