李錦偉 張艷 張紅 李承志 徐春雪 章文濤 李王海

急性動脈閉塞、肢體創(chuàng)傷、斷肢再植等?？梢鹣轮募毙匀毖?，是臨床常見的血管疾病之一，有較高的發(fā)病率和死亡率[1]，及時恢復肢體的血液灌注，避免肢體壞死是臨床上解決這一問題的主要方法。然而觀察發(fā)現(xiàn)，即使患肢恢復了血供，患者術(shù)后的肢體仍會面臨著壞死及危及生命的風險[2]，這與缺血后再灌注損傷有著密切的關(guān)系。而骨骼肌對缺血非常敏感，缺血后再灌注不僅可以引起骨骼肌壞死，還可累及其他重要臟器，引起多器官功能障礙，甚至導致死亡[3]。

然而，在急性下肢缺血的治療過程中，一旦閉塞的血管開通，組織恢復血液灌注后將引起不同程度的再灌注損傷，是影響患者預后的重要因素。因此，為了有效地預防和減輕缺血后再灌注損傷，需要在治療過程中對肌肉組織的損傷程度進行及時和準確的評估。

因此，本實驗擬通過建立兔后肢缺血后再灌注損傷的模型，對其進行后肢動脈的數(shù)字化減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA），并應用syngo iFlow彩色編碼后處理軟件分析DSA圖像，計算出組織灌注相關(guān)的參數(shù)指標，結(jié)合實驗室生化檢查，探討DSA彩色編碼成像技術(shù)在評價骨骼肌缺血后再灌注損傷中的價值。

材料與方法

一、動物模型

30只健康新西蘭大白兔購自暨南大學實驗動物管理中心，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，隨機均分為對照組與缺血再灌注 0 h、6 h、12 h、24 h組，每組6只。腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液（3～5 ml/kg）麻醉后，仰臥位固定，參考文獻[4]建立兔下肢缺血再灌注模型，中下腹部剪毛備皮消毒，恥骨聯(lián)合上取正中切口約3 cm，缺血再灌注各組完全暴露并縫扎右側(cè)髂總、髂外、髂內(nèi)、髂腰動脈，為防止尾動脈分支血管參與下肢骨骼肌供血，同時絲線捆扎尾巴，見右側(cè)髂外動脈塌陷蒼白、無搏動表示結(jié)扎成功，隨后DSA造影證實未見右后肢動脈血流；作3 h右后肢骨骼肌缺血處理后，解除右側(cè)髂總動脈縫扎，可見右后肢血管重新充盈并觸及動脈搏動則再灌注成功，隨后關(guān)閉腹腔，兔下肢缺血再灌注模型建立成功，分別按再灌注0 h、6 h、12 h、24 h分為4組后，進行雙后肢脈造影；對照組僅作開、關(guān)腹及暴露血管，不作缺血及再灌注處理。實驗嚴格遵守中華人民共和國科學技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》中的標準對動物的進行處置[5]。

二、造影方法與圖像后處理

缺血再灌注各組麻醉維持方法同前，頸部備皮后消毒鋪巾。取頸部正中切口暴露一側(cè)頸總動脈，以seldinger改良技術(shù)穿刺頸總動脈，送入微導絲及2.7F微導管，DSA透視導管送至腹主動脈中下段，以導管頭端距離髂動脈分叉約3 cm為宜。行雙后肢動脈造影方案為：西門子Artis Zeego血管造影機及工作站下，缺血再灌注各組及對照組以3 ml/s的流速經(jīng)導管以高壓注射（壓力：200 PSI）注入，造影劑使用碘克沙醇（320 mgI/ml），總量 9 ml，采集幀率為6幀/s，每組均采集至下腔靜脈顯影。

將采集的DSA原始數(shù)據(jù)導入西門子Leonardo后處理工作站，使用syngo iFlow軟件進行后處理得到彩色編碼圖像，從而得到時間密度曲線（time density curves，TDC）并提取出兩個重要參數(shù)：最大增強值（Peak）及達峰時間（time to peak，TTP）。從TDC曲線中得到每個像素點的Peak和TTP，利用色度、飽和度、亮度（hue，saturation and value，HSV）色彩模型對上述參數(shù)進行彩色編碼：飽和度（saturation）為常數(shù)，色度（hue）=TTP×240/360，亮度（value）=Peak，再利用公式將每個像素點的HSV值轉(zhuǎn)化為紅、綠、藍等各種顏色，顏色的亮度變化代表不同造影劑的強化程度，而色彩的冷暖變化代表不同的造影劑達峰時間，從而在單幅彩色圖像中顯示整個DSA序列。

由2名從事介入診療的醫(yī)師獨立采集參數(shù)：分別在雙側(cè)大腿的股外側(cè)肌區(qū)域?qū)ΨQ地選取面積約50 mm2大小的感興趣區(qū)（ROI），所選范圍避開骨骼，從而獲得并計算出右大腿最大強化值（PeakROIR），與左大腿最大強化值（PeakROI-L）的比值rPeak（rPeak＝PeakROI-R/PeakROI-L）。

三、實驗室檢查

完成實驗組缺血再灌注處理后及對照組假手術(shù)處理后在一側(cè)頸外靜脈采集血液標本3 ml，所有血液標本常溫靜置30 min后，以3 000 r/min對血液標本作離心處理15 min后取上清液，置于-20℃冰箱內(nèi)凍存，以備檢測。采用全自動生化分析儀測定乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）的含量；而超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD） 和 丙 二 醇（malondialdehyde，MDA）測定分別采用黃嘌呤氧化酶法及硫代巴比妥鈉法。實驗試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）及檢測儀器使用操作嚴格按照說明書進行。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，多組間的 rPeak、CK、LDH、MDA及SOD比較采用單因素方差分析，rPeak與CK、LDH、MDA、SOD生化指標的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組的血清LDH、CK、MDA、SOD水平及rPeak比較

與對照組相比，再灌注各組的血清LDH、CK、MDA含量均升高，SOD降低差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；隨著再灌注時間的延長，血清LDH及CK含量逐漸升高。而再灌注各組間的MDA、SOD含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。與對照組相比，再灌注各組rPeak值均降低，且隨著再灌注時間的延長逐漸下降，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表 1。

二、rPeak與實驗室指標的相關(guān)性分析

rPeak與LDH、CK、MDA之間均呈負相關(guān)（r分別為-0.885、-0.908、-0.541，均 P<0.05；），與 SOD 呈正相關(guān)（r=0.832，P<0.05），見圖 1。

討 論

缺血再灌注損傷的研究重心一直集中在心、腎、肝、腦、肺、腸等重要器官上[6]，但骨骼肌缺血再灌注損傷的檢測及治療同樣是急慢性外周動脈閉塞后再通、斷肢再植后所亟待解決的臨床難題，當前骨骼肌缺血再灌注損傷并不少見，病死率高達18%[7-8]。

Labbe等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在肌肉組織分別缺血3、4、5 h后，肌肉壞死的范圍分別為2%、30%、90%。其觀察發(fā)現(xiàn)肌肉的壞死在其中心部分更加嚴重，因此依靠外觀來判斷和評估骨骼肌的缺血再灌注損傷在臨床上是不可靠的。骨骼肌肌肉組織中I型肌纖維以有氧代謝為主要能量來源，對缺血缺氧非常敏感，容易發(fā)生缺血性損傷；而II型肌纖維能量來源主要是糖的無氧代謝[10]，股外側(cè)肌群以I型肌纖維為主，容易在缺血后發(fā)生再灌注損傷。缺血再灌注引起的微循環(huán)障礙導致組織血流灌注減少是造成再灌注損傷的重要原因，通過監(jiān)測肌肉組織的灌注情況來評估其損傷程度是一種可行的方法。

據(jù)徐春雪等[11]研究，電子計算機斷層掃描灌注成像（computed tomography perfusion imaging，CTPI）可早于形態(tài)學改變發(fā)現(xiàn)骨骼肌再灌注損傷情況，并可以較好地反映缺血再灌注損傷情況。但CTPI僅能在缺血再灌注發(fā)生后提供早期檢測手段，不能對骨骼肌缺血再灌注損傷程度進行實時有效的監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷。為此，臨床上需要一種更加客觀、準確并實時有效的方法來對骨骼肌缺血再灌注損傷進行判斷和評估。

表1 再灌注各組與對照組的血清LDH、CK、MDA、SOD水平及rPeak值比較 （±s）

表1 再灌注各組與對照組的血清LDH、CK、MDA、SOD水平及rPeak值比較 （±s）

注：IR為缺血再灌注；a為與對照組比較，P<0.05；b為與IR-0h組比較，P<0.05；c為與IR-6h組比較，P<0.05;d為與IR-12h組比較，P<0.05

分組對照組IR-0h組IR-6h組IR-12h組IR-24h組F值P值LDH（U/L）354.83±40.08 495.83±57.25a 1117.33±166.91ab 1574.33±238.20abc 2492.33±357.32abcd 104.54<0.05 CK（U/L）535.65±33.87 929.17±75.18a 4330.22±628.87ab 6636.88±395.55abc 10875.13±926.18abcd 391.54<0.05 MDA（nmol/ml）1.51±0.24 1.99±0.23a 2.11±0.28a 2.42±0.35a 3.07±0.60a 12.37<0.05 SOD（U/ml）173.54±5.47 165.79±3.78a 161.06±4.62a 153.14±4.72a 140.88±4.49a 43.34<0.05 rPeak 1.07±0.01 0.93±0.06a 0.79±0.05ab 0.65±0.04abc 0.47±0.04abcd 167.78<0.05

syngo iFlow是一種DSA圖像后處理技術(shù)，它通過彩色編碼算法，將對DSA圖像的主觀判斷轉(zhuǎn)化為客觀的參數(shù)化指標[12]，使其能夠量化地評估血流動力學狀況以及組織灌注情況。研究發(fā)現(xiàn)，與普通DSA圖像相比，彩色編碼技術(shù)在單幅圖像中對像素點進行顏色編碼，將灌注情況參數(shù)化、彩色化，從而顯示完整的血流灌注情況，使其具有可比性，增強圖像的可視性，從而全面直觀地顯示了血管疾病的病變范圍及程度[13]，對臨床醫(yī)師，特別是低年資臨床醫(yī)師診斷和評估腦血管疾病提供了很大的幫助。Su等[14]利用iFlow彩色編碼血流成像技術(shù)評價嚴重下肢動脈缺血腔內(nèi)治療前后的循環(huán)變化，但并未對彩色編碼血流圖像及反映缺血再灌注損傷的參數(shù)進行進一步分析及討論。

圖1 iFlow彩色編碼血管造影圖

因此，本研究選取了雙側(cè)股外側(cè)肌區(qū)域作為感興趣區(qū)，利用彩色編碼成像技術(shù)對DSA圖像進行處理，分別得到右側(cè)與左側(cè)肌肉組織的Peak值。由于不同個體的參數(shù)絕對值相差很大，我們采用比較相對比值的方法，最大程度地消除個體差異對實驗結(jié)果的影響。最后分別計算得出各組右后肢與左后肢Peak值的比值（rPeak）。研究結(jié)果顯示，再灌注各組的rPeak值均較對照組有不同程度的降低，隨著再灌注時間的延長，rPeak值逐漸下降，差異均有統(tǒng)計學意義。而rPeak與實驗室各指標的相關(guān)性分析顯示，rPeak與LDH、CK及MDA呈負相關(guān)，與SOD呈正相關(guān)。表明骨骼肌缺血再灌注過程中，iFlow的參數(shù)rPeak與實驗室指標的變化一致，組織在恢復灌注的初期就發(fā)生了損傷，隨著再灌注時間的延長，再灌注損傷的程度逐漸加重。

有研究通過觀察大鼠的比目魚骨骼肌缺血再灌注后的組織形態(tài)學發(fā)現(xiàn)[15]，在缺血4 h再灌注后24 h內(nèi)，肌肉組織的損傷將逐漸加重，隨著再灌注時間的延長，肌肉組織發(fā)生了更顯著和嚴重的形態(tài)學變化，光鏡下表現(xiàn)為細胞間質(zhì)腫脹、劇烈的炎性浸潤和肌纖維壞死，而在再灌注72 h后卻表現(xiàn)為炎性浸潤和纖維壞死減少，部分組織甚至出現(xiàn)再生的情況。這表明再灌注24 h的再灌注損傷最嚴重，本實驗中，再灌注24 h的rPeak值為再灌注各組中最低，符合上述組織形態(tài)學變化趨勢，可以認為rPeak值能夠在一定程度上反映再灌注損傷的嚴重程度，這為iFlow參數(shù)量化評估缺血再灌注損傷提供了重要的證據(jù)。

綜上所述，DSA圖像不僅可以顯示血管病變的部位、性質(zhì)和范圍等，還可以應用DSA彩色編碼技術(shù)對圖像進行后處理，計算并得到量化的參數(shù)指標rPeak，它與實驗室生化檢查都有著較好的相關(guān)性，而且rPeak值的變化趨勢又符合缺血再灌注過程中組織形態(tài)學的改變特點。因此，在急性下肢缺血的介入治療過程中，借助DSA彩色編碼成像后處理技術(shù)可以在不增加手術(shù)步驟、X線劑量及造影劑用量的前提下，對骨骼肌組織的灌注變化進行實時有效的監(jiān)測，及時發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷，并量化地評估其再灌注損傷的嚴重程度，從而為術(shù)中的后續(xù)治療策略和術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥的防治提供重要的參考和指導。

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