李玉明，武專昌，劉 珂，馬改妮，魏建超，邵東華，李蓓蓓，邱亞峰，石元元，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

PRRSV感染對豬肺泡巨噬細(xì)胞IFITM3基因轉(zhuǎn)錄的影響

李玉明，武專昌，劉 珂，馬改妮，魏建超，邵東華，李蓓蓓，邱亞峰，石元元，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3（interferon inducible transmembrane proteins 3，IFITM3）作為抗病毒蛋白可以抑制多種病毒的感染，本研究針對豬IFITM3基因設(shè)計(jì)特異性引物，構(gòu)建重組質(zhì)粒并作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，建立了檢測IFITM3基因的SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法最低檢出下限為102copies/μL，且線性關(guān)系好（R2≥0.997），敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于3%。將豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）細(xì)胞，在不同感染時(shí)間對細(xì)胞中IFITM3 mRNA 進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，PRRSV感染早期IFITM3轉(zhuǎn)錄水平保持不變，在感染后轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高。IFITM3 mRNA在PRRSV感染PAM過程中轉(zhuǎn)錄變化，可能是PRRSV宿主免疫逃逸的機(jī)制之一。

豬干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；SYBR Green I熒光定量PCR；豬肺泡巨噬細(xì)胞

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，主要引起母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸困難等癥狀[1]，感染后極易誘發(fā)繼發(fā)感染。PRRS由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，屬動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬[2]。PRRSV主要感染豬單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，尤其是豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）[3]。由于PRRSV抗原和基因多樣性以及病毒免疫抑制性，使得該病尚未具有有效的預(yù)防措施。

干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白 3（interferon inducible transmembrane proteins 3，IFITM 3）是一種抗病毒蛋白，可以抑制多種囊膜和非囊膜病毒的復(fù)制，如流感病毒、登革熱病毒、冠狀病毒等[4]。其抗病毒機(jī)制主要是干擾病毒和細(xì)胞膜的融合。在IFITM家族中至少有3個(gè)成員（IFITM1、IFITM2、IFITM3）具有抗病毒活性。越來越多的研究表明IFITM3在抵抗囊膜病毒的先天性免疫中起著關(guān)鍵作用。IFITM3主要在細(xì)胞內(nèi)體中表達(dá)，通過抑制病毒囊膜和內(nèi)體膜的融合阻礙病毒的進(jìn)入，從而發(fā)揮抗病毒作用[5,6]。本實(shí)驗(yàn)室通過對PRRSV感染和未感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染細(xì)胞中IFITM3顯著升高。本研究通過建立的熒光定量方法對感染PRRSV的PAM細(xì)胞中IFITM3基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，分析其動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，為研究IFITM3在PRRSV感染過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與病毒 5周齡健康斷奶仔豬3頭購自上海農(nóng)科院豬場，經(jīng)PCR和ELISA檢測PRRSV抗原及抗體均為陰性；豬肺泡巨噬細(xì)胞（porcine alveolar macrophages，PAM）按文獻(xiàn)[7]中方法進(jìn)行分離，并對分離的PAM進(jìn)行PCR檢測，選擇PRRSV、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬圓環(huán)病毒2 型（Porcinecircoviru-stype 2，PCV 2）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）陰性PAM細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；PRRSV SH-PRRS01株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 試劑和儀器 Trizol plus 試劑、反轉(zhuǎn)錄酶（MLV）、RNA酶抑制劑、ExTaqDNA聚合酶、Primescript RT master mix 快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR premix Ex Taq 熒光定量試劑盒、pMD-18T載體均購自 TaKaRa公司；膠回收試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；大腸桿菌感受態(tài)（DH5a）、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司；Step one plus熒光定量PCR儀購自ABI 公司。

1.3 豬IFITM3及GAPDH 基因SYBR Green I qRTPCR檢測方法的建立

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中登錄的豬IFITM3及GAPDH基因序列，應(yīng)用 Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物（表1）。所有引物均由上海Invitrogen生物公司合成。

表1 SYBR Green I qRT-PCR擴(kuò)增引物和條件Table 1 Ampli fi cation conditions and primers of the SYBR Green I qRT-PCR

1.3.2 豬IFITM3及GAPDH 基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 取PAM細(xì)胞并按照 Trizol 法說明書提取細(xì)胞總RNA，按MLV說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為：1 μL Random Primer、4 μL 5×RT Buffer、2 μL DTT、1 μL dNTP mix(10 mmol/L)、1 μL MLV（200 U/μL）、1 μL RNA酶抑制劑（20 U/μL）。然后以cDNA為模板，分別擴(kuò)增IFITM3及GAPDH基因片段，PCR體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/μL）4 μL、引物各0.5 μL（10 pmol/μL）、ExTaq酶0.5 μL、cDNA 模板3 μL，補(bǔ)H2O至25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后克隆至pMD18-T載體，并提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和測序鑒定后，測定DNA濃度，然后將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍系列稀釋至102copies/μL，做為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。

1.3.3 反應(yīng)體系優(yōu)化 在相同濃度模板的反應(yīng)體系中，采用矩陣法優(yōu)化引物的最佳濃度。在最佳引物濃度的反應(yīng)體系中，通過分析PCR擴(kuò)增效率，選擇最佳引物使用量進(jìn)行檢測。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍系列稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，經(jīng)Step one plus熒光定量PCR儀檢測，并自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后對SYBR Green I qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析和熔解曲線分析，確認(rèn)引物特異性后，對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次批內(nèi)重復(fù)檢測和3次批間重復(fù)檢測，同時(shí)設(shè)空白對照，通過計(jì)算批內(nèi)批間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）評價(jià)重復(fù)性。

1.4 PRRSV感染對PAM細(xì)胞內(nèi)IFITM3基因表達(dá)的影響 將分離的PAM細(xì)胞接種到24孔板中，以106細(xì)胞/孔進(jìn)行接種。在細(xì)胞貼壁后，換完全培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基）繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后，以1 MOI劑量的PRRSV進(jìn)行接種。接種1.5 h后，換維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并于接毒后不同時(shí)間收集細(xì)胞樣品并提取細(xì)胞總RNA，利用建立的熒光定量方法檢測IFITM3的mRNA拷貝數(shù)，并對PRRSV不同感染時(shí)間下，PAM細(xì)胞內(nèi)IFITM3轉(zhuǎn)錄變化進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒鑒定 分別擴(kuò)增IFITM3及GAPDH的目的片段，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定。結(jié)果表明，獲得大小分別為132、168 bp的片段（圖1）。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR反應(yīng)，其條帶大小與預(yù)計(jì)一致，測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的該基因序列完全相同，表明成功構(gòu)建IFITM3及GAPDH重組質(zhì)粒。

2.2 SYBR Green I qRT-PCR反應(yīng)的條件優(yōu)化 當(dāng)上游引物濃度為8 pmol/μL，下游引物濃度為10 pmol/μL時(shí)，擴(kuò)增效率最高。優(yōu)化后反應(yīng)體系為20 μL，包括：2×SYBR Green Premix ExTaqII 10 μL、上游引物8 pmol/μL、下游引物10 pmol/μL、模板（質(zhì)?；?cDNA（1 μg/mL））1 μL、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，補(bǔ)DEPC水至20 μL。反應(yīng)條件：95℃變性5 min；以95℃ 5 s，60℃ 30 s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，熔解曲線條件：60℃～95℃，每0.3℃讀板1次。

圖1 豬IFITM3、GAPDH基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Ampli fi cation of IFITM3 and GAPDH genes by PCR

2.3 SYBR Green I qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以IFITM3及GAPDH重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，制備6個(gè)濃度梯度，以此為模板進(jìn)行SYBR Green I qRT-PCR 擴(kuò)增并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，擴(kuò)增曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.997和1，擴(kuò)增效率分別為101.5%和95.8%（圖2）。

2.4 SYBR Green I qRT-PCR特異性實(shí)驗(yàn) 對IFITM3及GAPDH基因模板進(jìn)行SYBR Green I PCR檢測。熔解曲線分析表明，各基因均為特異性單峰，無雜峰（圖3），表明該反應(yīng)為特異性擴(kuò)增。

2.5 SYBR Green I qRT-PCR敏感性實(shí)驗(yàn) IFITM3及GAPDH檢測下限均為102copies/μL。對SYBR Green I qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖4所示，其不同濃度模板擴(kuò)增產(chǎn)物亮度呈梯度變化，與實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結(jié)果一致。

2.6 SYBR Green I qRT-PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取3個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)品（103～105copies/μL）作為模板，用建立的方法分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，其批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于3%（表2），表明該方法具有較高的重復(fù)性。

圖2 SYBR Green I qRT-PCR檢測豬IFITM3與GAPDH的擴(kuò)增曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig. 2 Ampli fi cation plots (A ) and standard curve (B) of SYBR Green I qRT-PCR

圖3 IFITM3及GAPDH基因的SYBR Green I qRT-PCR 溶解曲線Fig. 3 Melting curves of IFITM and GAPDH gene by SYBR Green I qRT-PCR for porcine IFITM3 and GAPDH gene

圖4 豬IFITM3、GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品PCR檢測結(jié)果Fig.4 PCR results for porcine IFITM3, GAPDH standard

表2 IFITM3及GAPDH基因SYBR GreenⅠqRT-PCR重復(fù)性結(jié)果Table 2 Reproducibility assay of SYBR GreenⅠqRT-PCR for porcine IFITM3 and GAPDH gene

2.7 樣品檢測結(jié)果 應(yīng)用建立的熒光定量方法對PRRSV感染的PAM中IFITM3和GAPDH進(jìn)行檢測，并計(jì)算其拷貝數(shù)，然后以IFITM3與GAPDH的拷貝數(shù)比值表示細(xì)胞內(nèi)IFITM3的相對含量，結(jié)果顯示在病毒感染初期（0～12 hpi），IFITM3基因轉(zhuǎn)錄水平幾乎無變化；到感染后期（12～24 hpi），IFITM3轉(zhuǎn)錄水平隨著感染時(shí)間的延長而持續(xù)增加，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。

圖5 PRRSV感染PAM細(xì)胞中IFITM3基因檢測結(jié)果Fig.5 Detection of mRNA levels of IFITM3 genes in PAM infected with PRRSV

3 討論

病毒和宿主屬于一種博弈的狀態(tài)，當(dāng)病毒感染細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞會(huì)通過表達(dá)干擾素等來抵抗病毒的入侵，同時(shí)病毒也會(huì)通過不同的策略抑制這些抵抗從而促進(jìn)自身的復(fù)制。IFITM3蛋白是一個(gè)重要的先天性免疫調(diào)節(jié)因子，它可以通過阻礙病毒的進(jìn)入來發(fā)揮抗病毒作用[5,6]，因此通過研究病毒感染細(xì)胞后IFITM3的表達(dá)情況有助于了解病毒與宿主之間的關(guān)系。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR因具有高敏感性、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)從而成為實(shí)驗(yàn)室檢測的主要方法之一。SYBR Green I PCR因其方法簡便、成本低廉而被廣泛應(yīng)用[8]。本研究根據(jù)GenBank中豬IFITM3和GAPDH基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并繪制SYBR Green I qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了針對該基因的熒光定量方法。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)以及擴(kuò)增效率極高，并能夠檢出下限為102copies/μL的基因含量，具有較高的敏感性；SYBR Green I RT-PCR產(chǎn)物單一熔解曲線和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果均表明該方法具有很強(qiáng)的特異性；組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于3%，表明該方法重復(fù)性很好。因此本研究建立的STBR Green I熒光定量RT-PCR可以用于IFITM3基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測。

目前研究者對IFITM3的抗病毒機(jī)制尚不清楚，有研究報(bào)道IFITM3可抑制囊膜病毒與細(xì)胞膜的融合，從而阻礙病毒的進(jìn)入[5,6]。本研究對PRRSV感染的PAM細(xì)胞中IFITM3基因轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在感染早期，IFITM3轉(zhuǎn)錄水平保持不變；到感染后期，隨著感染時(shí)間的增加，其轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高。因此推測，PRRSV可能在早期抑制了IFITM3的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)病毒的繁殖。PRRSV的這種免疫逃逸特性在其他方面也有報(bào)道，研究表明，PRRSV感染早期抑制細(xì)胞凋亡，晚期促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程，從而完成自身復(fù)制[9]。PRRSV在感染初期，干擾素的表達(dá)極低，后期才逐漸升高[10]。IFITM3是通過干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的一種蛋白，因此PRRSV可能通過抑制干擾素的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制IFITM3等抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸過程。

許多病毒在進(jìn)化過程中都具有拮抗宿主細(xì)胞抵抗的機(jī)制，但有關(guān)抑制IFITM3蛋白的機(jī)制尚沒有相關(guān)報(bào)道。本研究通過建立的SYBR Green I PCR熒光定量方法對IFITM3進(jìn)行檢測，為進(jìn)一步研究IFITM3在PRRSV等病毒感染過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

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EFFECT OF PRRSV INFECTION ON IFITM3 TRANSCRIPTION IN PORCINE ALVEOLAR MACROPHAGES

LI Yu-ming, WU Zhuan-chang, LIU Ke, MA Gai-ni, WEI Jian-chao, SHAO Dong-hua, LI Bei-bei,QIU Ya-feng, SHI Yuan-yuan, MA Zhi-yong

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

As an antivirus protein, interferon inducible transmembrane protein 3 (IFITM3) inhibits a broad spectrum of virus infections.In this study, the speci fi c primers were designed based on the genes of IFITM3 and GAPDH to detect IFITM3 expression in PRRSV-infected porcine alveolar macrophages (PAMs). The recombinant plasmids containing the target genes were constructed as a standard control and real time SYBR Green I RT-PCR method was developed for detection of IFITM3 expression. The results showed that the detection limit of this method was 102copies/μL with good linear relationship, specificity, sensitivity and repeatability. Moreover,the variation coef fi cient of the method was less than 3%. We used this method to detect the IFITM3 mRNA levels in PRRSV-infected PAMs. The results revealed that the IFITM3 mRNA levels showed no signi fi cant difference at the early stage of infection but increased significantly at the late stage of infection in PRRSV-infected PAMs as compared with mock-infected PAMs, demonstrating that the changes of IFITM3 mRNA levels in PRRSV-infected PAMs might be related to PRRSV infection as well as immune evasion.

Interferon inducible transmembrane protein 3; Porcine reproductive and respiratory syndrome virus; real time SYBR Green I RT-PCR; porcine alveolar macrophages

S852.44

A

1674-6422（2018）01-0007-06

2017-05-09

973項(xiàng)目計(jì)劃課題 (2014CB542702)；國家自然科學(xué)基金（31502046）

李玉明，男，博士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馬志永，E-mail: zhiyongma@shvri.ac.an