劉國平，劉 健，楊小林，胡利群，譚仕旦，趙書紅

（1.長江大學動物科學學院，荊州434025；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430070；3.恩施職業(yè)技術學院，恩施445000）

鏈球菌2型對恩施黑豬和美系純種長白豬的致病性研究

劉國平1,2，劉 健1，楊小林1,2，胡利群1,2，譚仕旦3，趙書紅2

（1.長江大學動物科學學院，荊州434025；2.生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢430070；3.恩施職業(yè)技術學院，恩施445000）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）病是一種能夠引起人和多種動物發(fā)病的重要人畜共患病，其中以2型（SS2）流行最廣，致病力最強，不僅可引起豬腦膜炎、關節(jié)炎、心內膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，還可以感染人并致其死亡，嚴重地威脅著人類的公共衛(wèi)生安全。本研究對恩施黑豬和美系長白豬進行豬鏈球菌2型的攻毒試驗，觀察其病理損害，進而探討其致病機制。20頭豬分A、B、C、D四個組，A組為 5頭恩施黑豬，B組為5頭美系長白豬，C、D兩組作為空白對照組。A、B組感染豬鏈球菌2型菌株，攻毒后都出現(xiàn)出現(xiàn)體溫升高、跛行和神經(jīng)癥狀，但A組恩施黑豬更加明顯，出現(xiàn)3頭死亡，解剖后各組織器官病變也比美系長白豬明顯。通過對病理器官組織切片、細菌學檢驗、細菌計數(shù)等結果，恩施黑豬對鏈球菌2型的易感性比美系長白豬更強，從而證實了豬鏈球菌2型對鄂西黑豬的致病性比美系長白豬更強。

豬鏈球菌2型；恩施黑豬；美系長白豬；致病機理

豬鏈球菌病（Streptococcus suis，S.suis）是一種重要的人獸共患病，根據(jù)其莢膜抗原的差異，豬鏈球菌分為 35 個血清型（1～34型和 1/2 型）。其中豬鏈球菌 2型（Strptococcus suisserotype 2，SS2）被認為是豬鏈球菌35個血清型（1～34型和1/2型）中分布最廣、致病性最強的一個血清型[1]。SS2感染人之后可以引起人的化膿性關節(jié)炎、腦膜炎、心內膜炎和中毒性休克綜合癥等[2]。1998 年、2005 年分別在我國江蘇海安縣和四川省資陽市暴發(fā)兩次豬鏈球菌病。不僅造成生豬死亡，引起養(yǎng)殖戶巨大經(jīng)濟損失，還導致人感染及死亡，嚴重地威脅著人類的公共衛(wèi)生安全[3]。

豬鏈球菌2型的毒力因子較為復雜，溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（extracellular factor，EF）、血凝素、溶血素haemolysin（豬溶素suilysin）及多糖夾膜（capsularpolysaccharide）、44 kDa蛋白、IgG結合蛋白、纖毛、粘著素等各種細菌組分，都被認為是毒力因子[4-6]。然而，這些成分在豬鏈球菌2型致病機制中的實際作用有待研究。

通過系統(tǒng)的流行病學監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌通常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染，發(fā)病率和死亡率有逐年上升趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)可造成極大地損失[7]。有研究顯示地方品種豬對疾病的抵抗力比外來品種豬要強[8-10]。鄂西黑豬（恩施黑豬）是湖北省西部山區(qū)“南型黑豬”的總稱[11]。隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化的發(fā)展，我國許多豬場從國外大量引種，其中新美系是養(yǎng)殖戶主要引進的種豬。新美系長白豬具有體型豐滿、生長速度快、雜交效果顯著和瘦肉率高的特點[12,13]，受到廣大養(yǎng)豬企業(yè)的歡迎。

國內外學者在豬鏈球菌的標準化動物模型方面作了大量工作，無菌仔豬、各種小鼠、家兔等被試用，但由于要求條件高、價格昂貴，或發(fā)病不規(guī)律等而受到局限[14,15]。有鑒于此，本試驗對地方代表品種豬恩施黑豬及外來品種美系長白豬進行致病性研究，對試驗過程中的臨床指標、病理學表現(xiàn)、致病性及致死性、炎性因子的表達等進行監(jiān)測，探討上述兩種豬對鏈球菌2型的易感性和先天性免疫機可能存在的差異。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬鏈球菌2型山東分離株[4]由長江大學動物科學學院分離鑒定并保存。

1.2 試劑及實驗動物 TSA、TSB購自上海生工公司，培養(yǎng)基按說明書制備；生化鑒定用試劑購自杭州天河微生物有限公司；豬鏈球菌2型高免血清由長江大學動物科學學院制備并保存[5]。選取30日齡純種恩施黑豬及純種美系長白豬。純種恩施黑豬（♂）由長江大學試驗豬場提供；美系純種長白豬（♂）購自宜昌正大種豬場。恩施黑豬和美系純種長白豬各10頭，在21日齡時購回，使用無抗飼料飼喂。恩施黑豬及長白豬在30日齡開展動物實驗前，均重為10 kg，差異不具有統(tǒng)計學意義。

1.3 實驗動物選擇 選擇臨床表現(xiàn)健康，采食量正常的21日齡豬。購豬及試驗前用滅菌拭子采集鼻腔、扁桃體樣本檢測SS2病原為陰性，同時對頸靜脈采血，用ELISA方法檢測其抗SS2抗體均為陰性。

1.4 菌種的復蘇與菌液的制備 室溫下解凍菌種，無菌條件下用接種環(huán)挑取少許菌種，以分區(qū)劃線法接種在TSA平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。眼觀復蘇菌種在TSA平板上的菌落大小、邊緣整齊度、濕潤度、隆起度、表面光滑度、顏色等。挑選單個可疑菌落作標記后，挑取少許按常規(guī)方法進行革蘭氏染色(革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色)，觀察革蘭氏染色后細菌在顯微鏡下的狀態(tài)。取鏡檢后確認的細菌按常規(guī)方法接種于TSA平板中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。挑取單菌落接種TSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h。各菌平板法計數(shù)后，調整菌液濃度至1×109CFU/mL，備用。

1.5 實驗豬的感染與臨床觀察 將20頭豬分A、B、C、D 4個組，A組為5頭恩施黑豬，B組為5頭美系長白豬，C組為5頭恩施黑豬，D組為5頭美系長白豬，分別飼養(yǎng)在獨立的欄中。攻毒前測量每頭豬的體溫。取1.4中制備好的菌液，對A、B兩組采用頸部肌肉注射，每頭注射4 mL（計4×109CFU），C、D兩組不注射作為對照組。攻毒后，保障充足的無抗飼料和飲水，每天觀察豬的臨床表現(xiàn)如飲食情況、體溫變化、跛行和神經(jīng)癥狀等。每4 h測量全部豬的直腸溫度。

1.6 病料采集與處理 豬死亡后立即解剖、拍照，無菌采取其肝臟、脾臟、心血、腦脊液、胃大小彎水腫液、腸系膜淋巴結等，將這些器官分別放入液氮罐和甲醛中固定。當死亡豬少于2只時，隨機挑選3只未死實驗豬在感染后人工處死，進行病理學及組織病理學觀察以及細菌學檢驗。液氮罐樣本進行炎性因子測定。

1.7 免疫器官的細菌計數(shù) 取肝臟、腦、肺臟、腎臟稱重后按10 mL/g加滅菌生理鹽水充分研磨，進行10倍系列稀釋至10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13。每個稀釋度取10μL涂布接種3個TSA平板，37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h檢驗平板。

1.8 免疫器官的病理學觀察 將實驗豬主要病變組織按常規(guī)技術進行細胞病理學及組織病理學檢驗，然后記錄結果。

1.9 免疫器官的相關因子芯片分析 使用一個周期的目標標簽和控制試劑（Affymetrix公司生物素標記的cRNA合成，加利福尼亞州圣克拉拉，美國）為雜交豬全基因組Affymetrix公司的芯片。從2 μg的總RNA中抽提12.5～20 mg的cRNA被用于進一步的碎片化，10 μg cRNA10用于雜交。雜交洗滌、染色和掃描芯片按照說明書進行，芯片分析用到的引物見表1。使用GeneSpring軟件進行數(shù)據(jù)分析。通路分析是使用基于Web的基因組分析工具包（Webgestalt）（Zhang等，2005）。所有芯片已提交的數(shù)據(jù)MIAME遵守下到ArrayEx按提交電子MEXP-1756（http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequnce

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀 接種后未采樣豬的臨床觀察期為15 d。接種后3 h，A、B組豬表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，較輕微的如扎堆、精神委頓、食欲不振或廢食、結膜潮紅、流淚；頸部、耳廓、腹下及四肢下端皮膚呈紫紅色，并有出血點；喜臥、便秘、糞便干燥，個別帶血。嚴重的出現(xiàn)關節(jié)腫大、跛行，全身發(fā)抖、共濟失調、角弓反張、轉圈運動等。A組豬的神經(jīng)癥狀更為明顯，其中3頭豬在接種35～50 h內相繼死亡，B組未出現(xiàn)死亡。攻毒后A、B兩組均出現(xiàn)體溫上升，上升趨勢見圖1，詳細體溫數(shù)值見表1和表2?？瞻讓φ战MC、D兩組飲食、體溫等均正常，無明顯的臨床癥狀。感染50 h后至整個觀察期結束，4組再無發(fā)生死亡。

圖1 攻毒后豬體溫變化趨勢Fig.1 Body temperature changes of pigs after infection

2.2 病理變化 對空白對照組進行剖檢，眼觀和顯微鏡下觀察組織切片均為正常組織狀態(tài)，無病變。各組織器官病理切片及解剖結果見圖2。

2.2.1 尸體剖檢病變 對已經(jīng)死亡的動物及瀕死期的病豬進行剖檢，病變主要表現(xiàn)為敗血癥癥狀（圖B）：病豬腹部皮下有出血點，血液凝固不良；腎臟有點狀出血點，被膜難剝離，腎皮質彌散性出血；肝臟腫大，表面有出血點，質度變脆；肺臟水腫；全身淋巴結腫大、出血，尤其頜下淋巴結、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結表現(xiàn)最為明顯（圖C、圖D）；心臟內膜有出血點；脾臟腫大、出血；扁桃體腫大，有出血點；胃內膜出血（圖E）。

2.2.2病理組織學觀察

2.2.2.1 心臟 心肌組織結構破壞，閏盤消失；心肌細胞顆粒變性，心肌細胞腫大，胞漿中見大量紅色蛋白性顆粒（圖 F）；心肌細胞水泡變性，心肌細胞腫脹、淡染，有的細胞呈空泡狀（圖 G）。對照組心肌結構清晰（圖 H）。

表1 攻毒后恩施黑豬的體溫變化情況Table 1 Temperature changes of Enshi black pigs after challenge

表2 攻毒后美系長白豬的體溫變化情況Table 2 Temperature changes of American landrace after challenge

2.2.2.2 肝臟 肝小葉結構被破壞，索狀結構消失，肝竇擴張，充滿紅細胞和其他血細胞（圖I）；細胞核凝固溶解，肝細胞腫脹，出現(xiàn)空泡樣變性，中央靜脈發(fā)生淤血（圖G）。對照組肝細胞索明顯可見（圖K）

2.2.2.3 脾臟 脾臟可見大面積出血，紅白髓混亂，脾小結不明顯，嗜中性粒細胞浸潤，淋巴細胞減少（圖 L）；壞死性脾炎，出血壞死部分細胞脫落。2.2.2.4 肺臟 肺臟可見間質性肺炎、肺泡隔充血、水腫，炎性細胞浸潤，間隔明顯增寬，肺泡縮?。挥械脑诜闻蓍g質可見大量纖維素滲出物和少量中性炎性粒細胞，脫落的肺泡上皮細胞。對照組肺泡壁薄，肺泡腔內沒有粘液等異物。

2.2.2.5 腎臟 腎小球體積腫大，充滿整個腎小囊（圖M）；腎小管出血，腎小管上皮細胞腫脹，管壁增厚，局部腎小管上皮細胞開始脫落（圖N、圖O）。對照組腎小球、腎小管清晰可辨，未見異常（圖P）。

2.3 細菌學檢測結果 A組豬的腦、肝臟、肺臟及腦積液、胸腔積液中均分離出了病原菌；B組在腦和腦積液中未分離到病原菌；C、D組均未分離到病原菌（表3）。

2.4 免疫器官的相關因子芯片分析 TLR2及TLR6的表達呈正相關，72 h采集樣本芯片分析結果表明，感染組肝臟及脾臟中TLR2及TLR6上調，美系長白豬組上調幅度更大（表4）。

2.5 分析 豬鏈球菌2型感染動物模型的建立是國內外學者一直探討的難題。迄今為止，由于豬鏈球菌2型的致病性復雜多變，是否由于品種的差異而對豬鏈球菌2型遺傳抗性不同并不清楚。

雖然鼻腔感染途徑更接近自然感染，但是缺乏重復性，因此我們選擇了靜脈方式感染。通過臨床觀察，攻毒后恩施黑豬體溫上升最終導致3頭豬死亡，而美系長白豬體溫上升后又經(jīng)72 h慢慢恢復正常，沒有出現(xiàn)死亡。這一現(xiàn)象說明了恩施黑豬對鏈球菌2型比美系長白豬更易感。組織病理學觀察結果進一步證實，恩施黑豬在感染后呈現(xiàn)以多器官組織出血為主的急性敗血癥變化，特別是肺臟、胃內膜、淋巴結、脾臟和腎臟出血較為嚴重，此外也呈現(xiàn)腦膜炎、心外膜炎和關節(jié)炎等特征性病變，這與崔立等[16]用SPF巴馬小型豬研究結果比較一致。通過細菌學檢驗結果，從恩施黑豬的實質器官中都分離到了病原菌；美系長白豬在腦和腦積液中未分離到病原菌；對照組C、D各器官中均未分離到病原菌，表明恩施黑豬對鏈球菌2型的易感性比美系長白豬要強。攻毒后通過對免疫器官中細菌計數(shù)發(fā)現(xiàn)，恩施黑豬免疫器官中細菌分部明顯比美系長白豬中要多。最后對免疫器官的相關因子芯片進行分析，TLR2及TLR6的表達呈正相關，72 h采集樣本芯片分析結果表明，肝臟及脾臟中，試驗感染組TLR2及TLR6上調，美系長白豬組上調幅度更大。由此可見，恩施黑豬對豬鏈球菌2型的易感性比美系長白豬更強?？傊ㄟ^本研究即兩種豬對鏈球菌2型的易感性和先天性免疫機存在差異，這將為進一步探討地方品種豬和外來品種豬的易感性和先天性免疫機的差異、易感性可能存在的遺傳特性、豬鏈球菌2型感染不同豬群的感染機制可能存在的差異提供實驗依據(jù)及思路，為進一步可能進行的優(yōu)良候選抗病基因篩選提供理論依據(jù)。

圖2 攻毒后豬的尸體剖檢病變圖Fig.2 The autopsy of pigs after challenge

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表3 實質器官的細菌計數(shù)檢測結果Table 3 The results of bacterial count test of solid organs

表4 感染前后TLR芯片分析結果Table 4 TLR analysis results before and after infection

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STUDY ON PATHOGENIC MECHANISM OF STREPTOCOCCUS SUIS SEROTYPE 2 TO BLACK PIGS IN ENSHI AND AMERICAN LANDRACE

LIU Guo-ping1,2, LIU Jian1, YANG Xiao-lin1,2, HU Li-qun1,2, TAN Shi-dan3, ZHAO Shu-hong2

(1. College of Animal Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, China; 2. The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Wuhan 430070, China; 3. Enshi Vocational and Technical College, Enshi 445000, China)

Streptococcus suis disease is an important zoonotic disease in humans and animals. Serotype 2 is the most prevalent and virulent, causing meningitis, arthritis, in fl ammation, sepsis, pneumonia and sudden death in pigs. In the present study, the pathogenicity of S. suis Serotype 2 was investigated in the Enshi black pigs native to western Hubei province and American Landrace. Twenty pigs were divided into four groups, 5 pigs each. Five Enshi black pigs and other 5 American Landrace pigs were infected with S. suis Sero type 2 strain. Non-infected controls included 5 Enshi black pigs and 5 American Landrace pigs. All infected pigs developed high body temperature, lameness and neurological signs. The Enshi black pigs showed more severe disease and pathological changes than American Landrace pigs. Three Enshi black pigs died. Examinations for clinical signs, histopathology and bacteriological isolation indicated that the Enshi black pigs were less susceptibility to S. suis Sero type 2 infection than American Landrace pigs.

Streptococcus suis serotype 2; Ensh black pig; American Landrace; pathogenicity

S852.611

B

1674-6422（2018）01-0071-06

2017-03-24

國家自然科學基金（36120006）

劉國平，男，副教授，主要從事動物傳染病學研究

劉國平，E-mail：hhaajjeerr@163.com