邢 濤，郁星星，朱愛軍，張紅飛，周光勝，張 敏，王海根，李金貴

（1.上海閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109；2.上海浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心南匯新城站，上海201303；3.上海浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心書院站，上海 201304；4.江蘇省揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

上海臨港地區(qū)豬源ETEC毒力因子及耐藥性調(diào)查

邢 濤1，郁星星2，朱愛軍3，張紅飛1，周光勝1，張 敏1，王海根1，李金貴4

（1.上海閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109；2.上海浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心南匯新城站，上海201303；3.上海浦東新區(qū)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心書院站，上海 201304；4.江蘇省揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

為了解上海市畜源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）的攜帶情況和耐藥性本底數(shù)據(jù)，對上海市臨港區(qū)域內(nèi)致仔豬腹瀉病原進(jìn)行多重PCR鑒定以及藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果顯示，從上海市臨港地區(qū)不同豬場240份樣品中分離得到3株ETEC，檢出率為1.25%。PCR結(jié)果表明成功分離到2株ST2型ETEC，1株LT1+ST2型ETEC，且其菌毛基因型均為F18ac。耐藥性分析表明，這3株細(xì)菌均對羧芐青霉素敏感，對呋喃妥因、左氧氟沙星中度敏感，對慶大霉素、四環(huán)素耐藥，對氨芐西林、恩諾沙星、多黏菌素B因菌株不同存在差異。結(jié)果表明上海市臨港地區(qū)豬群中確實(shí)存在高耐藥性ETEC，建議加強(qiáng)對ETEC的監(jiān)控。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；毒力因子；耐藥性；腹瀉；仔豬

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC）是一類致人和幼畜（初生仔豬、犢牛、羔羊及斷奶仔豬）腹瀉最常見的病原菌之一，由黏附素和腸毒素共同作用而成[1,2]。畜類攜帶以及畜源食品中污染的這類病原菌甚至是耐藥ETEC已成為威脅食品安全的重要風(fēng)險因素[3]。令人更為擔(dān)憂的是，動物源性食品中污染的ETEC致病菌不僅嚴(yán)重危害人類健康，而且養(yǎng)殖場濫用藥物會導(dǎo)致耐藥性ETEC的大量產(chǎn)生和廣泛傳播，這些耐藥菌通過生產(chǎn)鏈最終污染產(chǎn)品，使得食源性細(xì)菌疾病的防控和治療更加困難[4]。

上海市臨港地區(qū)畜類養(yǎng)殖場中ETEC的攜帶狀況及耐藥性尚未見相關(guān)調(diào)查報道，已嚴(yán)重影響到有關(guān)部門對于食品安全防控措施的研究和制定，摸清ETEC在臨港地區(qū)畜產(chǎn)品中的流行狀況及耐藥性情況，顯得格外重要與緊迫。本研究利用多重PCR診斷方法，對臨港地區(qū)致仔豬腹瀉ETEC毒力因子（腸毒素及黏附素）進(jìn)行PCR基因型鑒定，并利用藥敏試驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)耐藥性研究，可以初步掌握該地區(qū)畜產(chǎn)品中ETEC的攜帶情況及耐藥性數(shù)據(jù)，為制定詳細(xì)的控制動物源性食品污染技術(shù)提供理論支持，為防控食源性細(xì)菌疾病ETEC提供新思路。

1 材料與方法

1.1 病料 2015～2016年在上海市臨港地區(qū)3個當(dāng)?shù)匾?guī)模養(yǎng)豬場，無菌采集1～50日齡腹瀉仔豬糞便樣品共240份。取上述糞便少許，采用EMB培養(yǎng)基分離純化大腸桿菌，對分離菌進(jìn)行大腸桿菌生化指標(biāo)特性鑒定。對于符合大腸桿菌基本特征的分離菌，用LB液體培養(yǎng)基增菌，37℃培養(yǎng)12 h，備用[5]。

1.2 主要試劑 PCR試劑盒、DNA Marker DL2000購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖購自TaKaRa公司；檢測ETEC腸毒素（LT1、ST1、ST2）和黏附素（K88、K99、987P、F41、F18）特異性擴(kuò)增引物由上海生工生物工程有限公司合成；藥敏紙片購自O(shè)xoid公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[6-8]中的研究方法設(shè)計(jì)并合成ETEC腸毒素以及黏附素9對特異性引物，引物序列見表1、2。

表1 ETEC腸毒素?cái)U(kuò)增引物序列Table 1 ETEC enterotoxins ampli fi cation primers sequences

表2 ETEC黏附素?cái)U(kuò)增引物序列Table 2 ETEC adhesins ampli fi cation primers sequences

1.4 多重PCR鑒定 采用酚-氯仿抽提法提取細(xì)菌基因組作為ETEC多重PCR的反應(yīng)模板，參考文獻(xiàn)[9]中PCR方法并進(jìn)行優(yōu)化，對ETEC腸毒素基因型進(jìn)行鑒定，并以引物K88、987P、F41、K99、F18進(jìn)行ETEC黏附素基因型鑒定。

1.5 藥敏試驗(yàn)及臨床治療 取分離鑒定的ETEC，選用常用的藥敏紙片進(jìn)行藥物敏感性測定，根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（clinical laboratory standards institute，CLSI）制定的M100-S27文件推薦方法作為抗菌藥物敏感性的判定標(biāo)準(zhǔn)[10]。選用的藥敏紙片包括：羧 青霉素、氨 西林、頭孢拉定、頭孢曲松、左氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、阿米卡星、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、多黏菌素B、桿菌肽、呋喃妥因、呋喃唑酮等。選擇敏感藥物用于臨港地區(qū)豬場腹瀉仔豬的臨床治療，每天2次。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定結(jié)果 采用經(jīng)優(yōu)化過的多重PCR方法對ETEC能擴(kuò)增出特異性片段，其中，ST2型ETEC的條帶約為282 bp；LT1型ETEC的條帶約為360 bp；F18ac菌毛型的條帶為520 bp（圖1，2）。對240份豬場糞便樣品選擇性培養(yǎng)，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果獲得3株相應(yīng)的ETEC，其中2株為ST2型，1株為LT1+ST2型，檢出率為1.25%，分別命名為ETEC01、ETEC02、ETEC03。3株ETEC的菌毛均為F18ac型，未發(fā)現(xiàn)其他菌毛型細(xì)菌。

圖1 ETEC腸毒素基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR of enterotoxin genes in the ETEC isolates

圖2 ETEC菌毛基因PCR結(jié)果Fig.2 PCR of fi mbriae genes in the ETEC isolates

2.2 藥敏試驗(yàn)

2.2.1 抗菌藥物敏感性 根據(jù)CLSI的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)菌對抗菌藥物敏感性劃分為敏感（susceptible，S）、中介（intermediate，I）和耐藥（resistant，R）三類，藥物敏感性排序結(jié)果見表3。由表3可知，藥物敏感性排名前3位的抗生素為羧 青霉素、氨 西林和桿菌肽。耐藥性分析結(jié)果表明，上海市臨港地區(qū)分離的3株ETEC均對羧 青霉素敏感；對呋喃妥因、左氧氟沙星中度敏感；對頭孢拉定、頭孢曲松、慶大霉素、鏈霉素、阿米卡星、四環(huán)素耐藥，對氨 西林、桿菌肽、多黏菌素B、恩諾沙星、呋喃唑酮、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素因菌株不同也有差異。

2.2.2 多重耐藥性與耐藥譜 根據(jù)藥敏試驗(yàn)測定結(jié)果對上海臨港地區(qū)分離的3株產(chǎn)腸毒素大腸桿菌進(jìn)行多重耐藥性分析，本研究中ETEC的主要耐藥譜型有6種：分別是頭孢拉定（CED）、頭孢曲松（CRO）、慶大霉素（GEN）、鏈霉素（STR）、阿米卡星（AMK）、四環(huán)素（TET），其中ETEC03耐7種藥物，ETEC02耐8種藥物，ETEC01耐受藥物最多，可同時耐受10種藥物，結(jié)果見圖3。

2.2.3 臨床治療效果 通過上述分離菌株的耐藥性分析，對臨港地區(qū)腹瀉仔豬選用羧 青霉素進(jìn)行肌肉注射治療，適當(dāng)補(bǔ)液，同時采取加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、科學(xué)消毒以及減少應(yīng)激等綜合措施，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬場發(fā)病仔豬于治療后3～4 d停止腹瀉，以后逐漸平穩(wěn)，d6發(fā)病豬群基本恢復(fù)正常。

表3 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌分離株藥物敏感性測定Table 3 The sensitivity of the ETEC isolates to antibiotics

3 討論

美國農(nóng)業(yè)部最近連續(xù)監(jiān)測報告表明，腹瀉仍然主要危害著全球養(yǎng)豬生產(chǎn)，導(dǎo)致豬群中發(fā)病率和病死率最高，而ETEC是引起幼齡動物腹瀉的主要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后常因劇烈水樣腹瀉所致脫水而死亡[11]，發(fā)病率和死亡率均很高，如仔豬黃痢。更為嚴(yán)重的是，畜類攜帶以及畜源食品中污染的ETEC已成為威脅食品安全的重要風(fēng)險因子，這些人畜共患致病菌通過生產(chǎn)鏈最終污染餐桌上的食品，使得食源性細(xì)菌疾病的防控愈發(fā)困難[12]，嚴(yán)重威脅人類健康。

腹瀉性疾病是世界范圍內(nèi)一個重要的公共衛(wèi)生問題，尤其在欠發(fā)達(dá)國家，腹瀉每年可引起30～50萬名5歲以下兒童的死亡。導(dǎo)致這些嬰幼兒腹瀉的一個最常見病原是ETEC[13]。感染性腹瀉的反復(fù)發(fā)作，可導(dǎo)致嬰幼兒患者生長阻滯和營養(yǎng)不良，進(jìn)而惡性循環(huán)，甚至引發(fā)死亡。這類病原菌也一直是西方國家旅行者腹瀉的最常見病因，常常困擾著被部署在疫區(qū)的軍事人員。因此，ETEC所引發(fā)的一系列感染危害已最終演變成一個重要的公共衛(wèi)生問題[14]。

圖3 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌分離株對常用16種抗菌藥的耐藥譜Fig.3 Drug resistance spectrum of ETEC isolates to commonly used 16 antimicrobial agents

段強(qiáng)德等[15]研究表明，F(xiàn)18ac菌毛常見于ETEC菌體表面，可介導(dǎo)細(xì)菌對小腸細(xì)胞的黏附，是致斷奶仔豬腹瀉大腸桿菌ETEC相關(guān)2134P、8199、8813菌毛的重要致病毒力因子，其結(jié)合到宿主易感上皮細(xì)胞是ETEC感染的第一步，也是最重要的關(guān)鍵步驟。成大榮等[16]對江蘇省斷奶仔豬源ETEC進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ETEC 最主要的黏附因子是F18 菌毛，其中F18ab 菌毛占66.49 %；F18ac菌毛占33.33%。本研究分離的3株ETEC菌毛基因型均為F18ac，說明不同地區(qū)流行的ETEC菌毛優(yōu)勢基因型是不同的。

蔣磊等[17]報道，引起斷奶仔豬腹瀉的ETEC與人源ETEC菌株相似，可以表達(dá)熱敏腸毒素（LT1）或/和熱穩(wěn)定腸毒素（ST2）。本研究分離到的豬源ETEC病原菌腸毒素基因型分別為ST2型（ETEC01、02）和LT1+ST2型（ETEC03），進(jìn)一步證實(shí)豬源ETEC分離株和人源菌株相同，都能表達(dá)腸毒素LT1或/和ST2，這可能是獨(dú)特的宿主受體特異性決定的，這些結(jié)果提示豬源ETEC可以提供了解和預(yù)防人類感染的重要線索，也為人類ETEC疾病的診斷、預(yù)防和治療開辟一條新途徑。

依據(jù)CLSI推薦的斷點(diǎn)對體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定，結(jié)果表明3株ETEC分離株均具有很強(qiáng)的多重耐藥性，最多可同時耐受10種抗菌藥物，僅對羧 青霉素敏感。這些耐藥性ETEC很有可能通過生豬—豬肉—人的食物鏈條傳遞給人類，以人源和豬源相重疊的共生菌為載體，轉(zhuǎn)移耐藥性基因[18]對公共健康造成嚴(yán)重威脅。因此，應(yīng)強(qiáng)化源頭治理，加強(qiáng)對上海地區(qū)豬場高耐藥性ETEC的監(jiān)控，防止抗生素耐藥性畜產(chǎn)品流入市場。

本研究開展的豬源ETEC毒力因子和耐藥性本底數(shù)據(jù)調(diào)查有助于我們初步掌握ETEC在上海臨港地區(qū)畜產(chǎn)品中的流行狀況及耐藥性情況，可以用于指導(dǎo)臨床ETEC感染的預(yù)防和治療。此外，本研究結(jié)果還有助于分析畜源ETEC感染程度和毒力風(fēng)險，可以為食品安全防控政策的研究與制定提供必要的參考依據(jù)，對于深入了解ETEC病原菌的致病機(jī)理、傳播特點(diǎn)和感染強(qiáng)度都具有重要意義[19]。

多年來，抗生素結(jié)合大腸桿菌疫苗的高強(qiáng)度使用在一定程度上降低了養(yǎng)殖場斷奶仔豬的腹瀉率，其功效在于特異性抑制體內(nèi)已感染的ETEC致病菌，但外界環(huán)境污染的大量病原菌得不到有效清除。從分子水平研究ETEC黏附素與易感宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合、相互作用的精確機(jī)制，才能高效、特異性封閉或阻斷ETEC致病菌與腸道上皮細(xì)胞受體的結(jié)合，從而開辟出一種非抗生素干預(yù)控制ETEC感染的新方法[20]。

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PREVALENCE OF VIRULENCE FACTORS AND ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY OF ENTEROTOXIGENIC E.COLI FROM PIGLETS IN LINGANG DISTRICT, SHANGHAI

XING Tao1, YU Xing-xing2, ZHU Ai-jun3, ZHANG Hong-fei1, ZHOU Guang-sheng1, ZHANG Min1,WANG Hai-gen1, LI Jin-gui4

(1.Agriculture Service Centre of Pudong District Nanhui New Town, Shanghai 201303, China; 2.Minhang Center for Animal Disease Control and Prevention, Shanghai 201109, China; 3.Agriculture Service Centre of Pudong District ShuyuanTown, Shanghai 201304,China; 4.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

The multiple PCR identification and drug susceptible test were applied in order to investigate the prevalence and drug resistance of enterotoxigenic E.coli (ETEC) in piglets in Lingang, Shanghai. Three ETEC isolates were obtained from 240 samples collected from different pig farms and con fi rmed as F18ac positive by PCR. Among three ETEC isolates, 2 isolates were determined to be ST2+and another isolate was LT1+and ST2+. These three ETEC isolates were tested for resistance to seven antibiotics. As a result,all three isolates were highly susceptible to carbenicillin, moderately susceptible to nitrofurantoin and levofloxacin and resistant to gentamicin and tetracycline. The susceptibility of these isolates varied to ampicillin, enro fl oxacin and polymyxin B.

Enterotoxigenic E.coli; virulence factors; antimicrobial resistance; diarrhea; piglet

S858.28

A

1674-6422（2018）01-0055-05

2017-03-07

上海市科技興農(nóng)推廣項(xiàng)目（滬農(nóng)科推字(2015)第1-5號）。

邢濤，男，獸醫(yī)師，主要從事動物疫病防控和臨床診療

李金貴，E-mail：jgli@yzu.edu.cn