田占成，獨軍政，高閃電，杜曉悅，于瑞明，劉光遠(yuǎn)，羅建勛，殷 宏

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州730046）

環(huán)形泰勒蟲TRAP-A蛋白酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

田占成，獨軍政，高閃電，杜曉悅，于瑞明，劉光遠(yuǎn)，羅建勛，殷 宏

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州730046）

為了篩選出環(huán)形泰勒蟲TRAP蛋白在蟲體入侵媒介蜱唾液腺過程中相互作用蜱源蛋白, 構(gòu)建了能夠用于酵母雙雜交篩選系統(tǒng)的重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以環(huán)形泰勒蟲裂殖體為材料，根據(jù)環(huán)形泰勒蟲TRAP-A結(jié)構(gòu)域的基因序列設(shè)計引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得576 bp的基因片段，將其連接到線性化載體 pGBKT7上。經(jīng)雙酶切鑒定和序列分析以及重組誘餌質(zhì)粒在酵母雙雜交系統(tǒng)中的自激活、細(xì)胞毒性及其表達(dá)情況檢測，結(jié)果顯示，本研究成功構(gòu)建了酵母雙雜交重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A，構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒對Y2HGold酵母菌無自激活活性和細(xì)胞毒性，且構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌內(nèi)正確表達(dá)。表明所構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A可以用于篩選小亞璃眼蜱唾液腺酵母雙雜交cDNA文庫，獲得可能與環(huán)形泰勒蟲TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。

酵母雙雜交系統(tǒng)；環(huán)形泰勒蟲；TRAP-A蛋白；自激活；細(xì)胞毒性

血小板反應(yīng)相關(guān)粘附蛋白（thrombospondin—related adhesive protein，TRAP）是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外的血小板結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域（thrombospodin-like domain，TSR）和或整合素A樣結(jié)構(gòu)域（integrin A-like domain）、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域（cytoplasmic tail domain，CTD）組成[1,2]，是由多基因編碼的大家族，屬于微線體蛋白。結(jié)構(gòu)上與弓形蟲MIC2[3]和球蟲Etp100[4]相似，TRAP家族成員的胞質(zhì)部分通過醛縮酶連接肌動馬達(dá)復(fù)合物，輔助蟲體滑行運動入侵宿主細(xì)胞。TRAP家族蛋白具有種屬和發(fā)育階段的特異性，與頂復(fù)門原蟲入侵宿主細(xì)胞的特異性密切相關(guān)[5]。TRAP胞外結(jié)構(gòu)的多樣性使其可以入侵不同的組織和細(xì)胞[6]。

不同寄生蟲入侵的宿主不同，可能與細(xì)胞表面受體有關(guān)，也可能與不同寄生蟲表達(dá)的TRAP家族蛋白成員的差異有關(guān)。瘧原蟲在媒介體內(nèi)發(fā)育成熟過程中，瘧原蟲動合子CTRP（TRAP家族成員之一）與層粘連蛋白結(jié)合，有助于瘧原蟲動合子入侵蚊子中腸上皮細(xì)胞；子孢子表面的TRAP蛋白介導(dǎo)瘧原蟲入侵肝細(xì)胞的同時，與蚊子唾液腺的saglin結(jié)合有助于入侵蚊子唾液腺。瘧原蟲裂殖子階段MTRAP蛋白是滑行運動馬達(dá)復(fù)合體的組成成員之一，幫助蟲體滑行運動入侵紅細(xì)胞[7]。與瘧原蟲在媒介體內(nèi)的生活史類似，環(huán)形泰勒蟲在媒介蜱的中腸和唾液腺的上皮細(xì)胞要完成配子生殖和孢子生殖兩個階段，在這一過程中，涉及到了環(huán)形泰勒蟲子孢子和動合子兩個發(fā)育階段識別媒介蜱唾液腺和中腸表面分子的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，研究環(huán)形泰勒蟲子孢子和動合子入侵相關(guān)蛋白與蜱源互作蛋白的相互作用分子機(jī)制，對于了解環(huán)形泰勒蟲在媒介蜱體內(nèi)發(fā)育成熟分子機(jī)制至關(guān)重要。

在已注釋的環(huán)形泰勒蟲裂殖子基因組和裂殖體蛋白組中，可以找出與瘧原蟲子孢子入侵粘附素TRAP的同源基因。因此，環(huán)形泰勒蟲入侵粘附素TRAP蛋白可能在入侵媒介蜱唾液腺過程中發(fā)揮重要作用。為了弄清楚環(huán)形泰勒蟲TRAP蛋白在入侵媒介蜱唾液腺過程中的作用機(jī)制，本文構(gòu)建了環(huán)形泰勒蟲TRAP基因整合素結(jié)構(gòu)域（TRAP-A）的酵母雙雜交系統(tǒng)誘餌質(zhì)粒，旨在為今后從小亞璃眼蜱唾液腺酵母雙雜交文庫中篩選出環(huán)形泰勒蟲TRAP-A互作的蜱源蛋白提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 真核表達(dá)載體pGBKT7、酵母菌株Y2HGold、pGEM-T Easy載體均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室保存；X-α-Gal及各種酵母培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化所需試劑均購自Clontech公司；Agarose Gel DNA Purification Kit、X-Gal、限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、酵母蛋白抽提液、Agarose Gel DNA回收試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、ECL顯色液購自Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank中已發(fā)表的TRAP基因（XP_952976）序列，利用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計用于擴(kuò)增TRAP基因整合素結(jié)構(gòu)域（TRAP-A）的表達(dá)引物，分別在上下游引物引入EcoR I和BamH I酶切位點，委托南京金斯瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。上游引物TRAP-A-F：5'-GCGAATTCATGGACTTTGTAGTAATGCTCG-3'（EcoR I酶切位點）；下游引物TRAP-A-R：5'-TCGGATCCTTAGTCGACCAACTCTTGCAG -3'（BamH I酶切位點）

1.3 TRAP-A基因的克隆和序列分析 離心收集環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的淋巴細(xì)胞，利用TRIzol試劑提取環(huán)形泰勒蟲裂殖體的總RNA。經(jīng)1%凝膠電泳鑒定合格后用M-MLV Reverse Transcriptase Kit將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用合成的特異性引物和裂殖體cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析后，將目的片段經(jīng)Agarose Gel DNA Purification Kit回收純化后克隆到pGEM-T Easy載體，再轉(zhuǎn)化為大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。采用常規(guī)方法提取質(zhì)粒，PCR鑒定后，挑取3～5個陽性克隆送至南京金斯瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序片段經(jīng)對比分析后進(jìn)行拼接，鑒定正確的陽性克隆命名為pGEM-T-TRAP-A。應(yīng)用DNAStar軟件將TRAP-A基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對分析。

1.4 pGBKT7-TRAP-A誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將上述鑒定的陽性質(zhì)粒pGEM-T-TRAP-A用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切后，定向插入經(jīng)同樣雙酶切的線性化載體pGBKT7中，轉(zhuǎn)化為大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。重組誘餌質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后，送至南京金斯瑞生物工程有限公司進(jìn)行測序，將含有正確插入TRAP-A基因的誘餌質(zhì)粒命名為pGBKT7-TRAP-A。

1.5 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold參照Yeast maker yeast transformation system protocol制備酵母Y2HGold菌株感受態(tài)細(xì)胞，取制備好的酵母感受態(tài)細(xì)胞50μL加入5μL處理過的Yeast maker carrier DNA和100 ng的高質(zhì)量重組質(zhì)粒，再加入500 μL PEG/LiAc輕輕混勻，于30℃水浴孵育30 min，再加入20 μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕混勻后置于42℃水浴孵育15 min后，室溫1000×g離心15 s，棄去上清，沉淀用1 mL的YPD Plus重懸，然后室溫1000×g離心15 s，棄去上清，用1 mL的0.9%NaCl溶液重懸，鋪于營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp，30℃溫箱倒置培養(yǎng)3～5 d；待白色克隆長出，挑取直徑在2～3 mm的單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以驗證誘餌質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化成功。

1.6 pGBKT7-TRAP-A對報告基因自激活的檢測 將轉(zhuǎn)化有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A和空載體pGBKT7的酵母Y2HGold分別接種于營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal、SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察酵母Y2HGold在各培養(yǎng)基上的生長情況和菌落顏色變化，檢測pGBKT7-TRAP-A對報告基因有無自激活作用。

1.7 pGBKT7-TRAP-A對酵母Y2HGold的毒性檢測 從SD/-Trp培養(yǎng)基上分別挑取已轉(zhuǎn)化成功的pGBKT7-TRAP-A和空載體pGBKT7的酵母Y2HGold單克隆接種于5 mL SD/-Trp/Kan(含卡那霉素50 μg/μL)液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)15～20 h，測定培養(yǎng)物的OD600值。若OD600<0.8，說明pGBKT7-TRAP-A對酵母Y2HGold可能有毒性；若OD600≥0.8，說明沒有毒性。

1.8 重組誘餌蛋白TRAP-A的表達(dá)情況檢測 挑取帶有空載體質(zhì)粒pGBKT7和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A的酵母菌落至1.5 mL的離心管中，加入1 mL預(yù)冷的超純水，4℃、8000×g離心2 min。棄上清，加入100 μL Yeast Protein Extraction Regent混勻，置于30℃水浴孵育30 min，4℃、12 000×g離心5 min；棄上清，加入25 μL PBS重懸即為提取酵母總蛋白。蛋白加loading buffer混勻經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，用5%的脫脂奶粉封閉過夜，孵育的一抗為原核表達(dá)重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備的抗TRAP-A多克隆抗體；二抗為堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG，最后用ECL避光顯色。

2 結(jié)果

2.1 TRAP-A基因的PCR擴(kuò)增及誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 以環(huán)形泰勒蟲裂殖子cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得1條576 bp左右的目的條帶（圖1），PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到pGEM-T-Easy載體上送南京金斯瑞生物工程有限公司測序分析，確定為環(huán)形泰勒蟲TRAP-A基因片段；構(gòu)建好的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶切，得到7300 bp左右的載體條帶和576 bp左右的目的條帶（圖2）。測序結(jié)果顯示，TRAP-A基因按正確的編碼閱讀框插入到pGBKT7載體多克隆位點，且堿基未產(chǎn)生突變，說明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A構(gòu)建成功。

2.2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold在SD/-Trp缺陷性培養(yǎng)基上，可見含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A的白色克隆長出。隨機(jī)挑取4個白色單克隆進(jìn)行菌落PCR驗證，經(jīng)電泳檢測，在576 bp附近得到很亮的目的條帶，表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A成功轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGold細(xì)胞中（圖3）。

2.3 pGBKT7-TRAP-A對報告基因自激活的檢測 轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A的酵母Y2HGold在SD/-Trp/X-α-Gal平板上可見白色菌落生長，而在SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal、SD/-His/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal平板上未見菌落生長，其生長特性與空載體pGBKT7轉(zhuǎn)化的酵母Y2HGold一致（圖4）。表明pGBKT7-TRAP-A在酵母細(xì)胞中對報告基因Ade、His、Leu和LacZ沒有自激活作用，可用于后續(xù)的酵母雙雜交的篩選工作。

圖1 環(huán)形泰勒蟲TRAP-A基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR ampli fi cation of Theileria annulataTRAP-A gene

圖2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A酶切鑒定分析Fig.2 Analysis of pGBKT7-TRAP-A by enzymatic digestion

圖3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A的菌落PCR鑒定Fig.3 Identi fi cation of bait plasmids pGBKT7-TRAP-A by PCR

圖4 白色菌落Fig.4 White bacterial colony

表1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A對報告基因自激活的檢測Table 1 Autoactivity test of bait plasmid pGBKT7-TRAP-A to the reporter gene

2.4 pGBKT7-TRAP-A對酵母Y2HGold的毒性檢測 從SD/-Trp培養(yǎng)基上分別挑取已轉(zhuǎn)化成功的pGBKT7-TRAP-A和空載體pGBKT7的酵母Y2HGold單克隆菌株接種于5 mL SD/-Trp/Kan（含卡那霉素50 μg/μL）液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min震蕩培養(yǎng)18 h，測定其OD600值分別為2.185和2.216，重復(fù)2次的OD600值均大于0.8。說明pGBKT7-TRAP-A對酵母Y2HGold的生長沒有毒性。

2.5 pGBKT7-TRAP-A在Y2HGold酵母細(xì)胞中的表達(dá)檢測 酵母細(xì)胞蛋白提取液經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，Western blot檢測空載體pGBKT7和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A轉(zhuǎn)化的酵母菌，結(jié)果表明含pGBKT7空載體的酵母蛋白無特異反應(yīng)條帶；轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A的酵母蛋白可見1條特異性反應(yīng)條帶, 蛋白分子量大小為40 kDa，與預(yù)期結(jié)果一致，說明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A在酵母Y2HGold細(xì)胞中成功表達(dá)（圖5）。

3 討論

頂復(fù)門原蟲入侵宿主細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程，包括粘附、入侵、宿主細(xì)胞內(nèi)形成納蟲空泡、蟲體在納蟲空泡內(nèi)發(fā)育以建立寄生生活，在此過程中一些保守存在的關(guān)鍵性蛋白參與了蟲體與宿主細(xì)胞的粘附和侵入。頂復(fù)門原蟲微線體蛋白TRAP在寄生蟲與宿主細(xì)胞互作方面有較為深入的研究，且在瘧原蟲入侵蚊蟲唾液腺過程中發(fā)揮重要的生理功能，與瘧原蟲在媒介體內(nèi)生活史相似的環(huán)形泰勒蟲相比，盡管在環(huán)形泰勒蟲裂殖子基因組和裂殖體蛋白組中可以找到與其他頂復(fù)體原蟲同源的TRAP家族成員，且探索了巴貝斯蟲裂殖子TRAP蛋白在入侵宿主紅細(xì)胞過程中的作用機(jī)制[8,9]，但由于缺乏對泰勒蟲在媒介蜱體內(nèi)發(fā)育成熟過程的系統(tǒng)研究，以及在環(huán)形泰勒蟲子孢子或動合子體外培養(yǎng)技術(shù)和反向遺傳技術(shù)尚有一定困難，限制了環(huán)形泰勒蟲TRAP蛋白在環(huán)形泰勒蟲入侵媒介蜱唾液腺過程中的作用研究。

圖5 pGBKT7-TRAP-A在酵母細(xì)胞中的表達(dá)檢測Fig.5 The expression of pGBKT7-TRAP-A in yeast cells Y2HGold

本研究以環(huán)形泰勒蟲入侵粘附素結(jié)構(gòu)域TRAP-A為誘餌蛋白，為了獲得TRAP-A的互作蜱源蛋白，選擇使用高效傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)來進(jìn)行篩選。酵母雙雜交系統(tǒng)是Fields和Song[10]于1989年建立的基于酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的特性，分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的基因系統(tǒng)。該系統(tǒng)既可以研究兩種已知蛋白的相互作用，又可用于研究已知蛋白和未知蛋白的相互作用，而且允許直接克隆未知蛋白的基因。酵母雙雜交系統(tǒng)是近年來廣泛應(yīng)用的一種研究蛋白質(zhì)之間相互作用的強有力方法[11-13]，已成為目前研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的常用和最有利的工具[12]。

酵母雙雜交系統(tǒng)能夠被很好應(yīng)用的前提是構(gòu)建符合酵母雙雜交系統(tǒng)篩選特性的誘餌質(zhì)粒。為篩選與環(huán)形泰勒蟲TRAP-A蛋白相互作用的蜱源互作蛋白，本研究構(gòu)建了用于酵母雙雜交系統(tǒng)篩選用的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-TRAP-A，經(jīng)過PCR、雙酶切鑒定和測序比對，證實了插入多克隆位點的TRAP-A基因序列的正確性。通過將轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的Y2HGold酵母菌培養(yǎng)在不同營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，觀察其生長情況和顏色變化，直觀地判斷誘餌載體對報告基因沒有自激活作用，從而排除了假陽性的可能。同時轉(zhuǎn)化誘餌質(zhì)粒的Y2HGold酵母菌在SD/-Trp/Kan液體培養(yǎng)基中能大量繁殖，說明表達(dá)的誘餌蛋白對Y2HGold酵母菌生長無毒性作用。使用實驗室已有的抗TRAP-A兔血清對pGBKT7-TRAP-A誘餌質(zhì)粒在Y2HGold酵母菌株中的蛋白進(jìn)行了Western blot檢測，結(jié)果獲得了與預(yù)期重組TRAP-A蛋白分子量大小相近的特異條帶，表明pGBKT7-TRAP-A誘餌質(zhì)粒在Y2HGold酵母菌中能夠穩(wěn)定表達(dá)誘餌蛋白。

本研究構(gòu)建的pGBKT7-TRAP-A誘餌質(zhì)粒產(chǎn)生的蛋白對Y2HGold酵母菌的生長無細(xì)胞毒性，對Y2HGold酵母菌自帶的報告基因無自激活作用，且在Y2HGold酵母菌中能夠表達(dá)誘餌蛋白。因此可以利用TRAP-A作為誘餌蛋白，為后續(xù)利用酵母雙雜交技術(shù)從小亞璃眼蜱唾液腺酵母文庫中篩選與環(huán)形泰勒蟲TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白，探索環(huán)形泰勒蟲入侵媒介蜱唾液腺及環(huán)形泰勒蟲在媒介蜱體內(nèi)的發(fā)育成熟分子機(jī)制提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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CONSTRUCTION AND IDENTIFICATION OF THE PGBKT7-TRAP-A PLASMID

TIAN Zhan-cheng, DU Jun-zheng, GAO Shan-dian, DU Xiao-yue, YU Rui-ming, LIU Guang-yuan,LUO Jian-xun, YIN Hong

(State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, CAAS, Lanzhou 730046, China)

In the present study, the bait plasmid of pGBKT7-TRAP-A were constructed to screen the interactive proteins derived from the salivary glands of Hyalomma anatolicum anatolicum with Theileria annulata TRAP-A protein. The ampli fi cation primers were designed based on the sequence of TRAP-A adhensive domain of annulata merozoite. The fragment with the length of 576 bp was ampli fi ed and ligated into the pGBKT7vector. The pGBKT7-TRAP-A plasmid was con fi rmed using enzyme digestion and sequence analysis and then transformed into yeast cells Y2HGold. The TRAP-A fusion protein was expressed and examined for its autoactiviation and toxicity to yeast growth. Results indicated that the TRAP-A fusion protein was expressed in yeast cells Y2HGold without interruption of cellular growth. In addition, the recombinant protein had no transcription activity of reporter genes or toxicity to the yeast cells Y2HGold.Therefore, the pGBKT7-TRAP-A plasmid may be used for the screening of the interactive proteins from Hyalomma anatolicum anatolicum in yeast two-hybrid system.

Yeast two-hybrid system; Theileria annulata; TRAP-A Protein; autoactiviation; toxicity

S852.723

A

1674-6422（2017）06-0060-06

2017-03-13

國家自然科學(xué)基金（31201899）

田占成，男，副研究員，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

殷宏，E-mail：yinhong@cass.cn; 田占成，E-mail：tianzhancheng@caas.cn