樊 琛，曾慶華，王 會(huì)，李 燕，劉桂芹，孫小凡，鄭煥芹

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城 252059）

抗Iss抗血清抑制雞大腸桿菌血清抗性的分析

樊 琛，曾慶華，王 會(huì)，李 燕，劉桂芹，孫小凡，鄭煥芹

（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城 252059）

iss基因是雞大腸桿菌的毒力基因，與菌株的血清抗性有關(guān)。本研究采用GST-Iss融合蛋白免疫4～6周齡小鼠，間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)，并檢測(cè)雞致病性大腸桿菌O2（O2血清型）、CVCC1553（O78血清型）菌株Iss蛋白的表達(dá)。通過(guò)體外血清抗性抑制試驗(yàn)及iss、ybtA、chuA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)2株菌株的血清抗性變化及mRNA轉(zhuǎn)錄水平的改變。結(jié)果表明，鼠源抗Iss抗血清能夠在體外試驗(yàn)中抑制O2、CVCC1553菌株的血清抗性，并降低iss、ybtA及chuA基因的轉(zhuǎn)錄，并且對(duì)不同血清型菌株均有效。由此推測(cè)，抗Iss抗血清可能通過(guò)降低血清抗性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使致病性菌株的血清抗性下降。Iss蛋白可能具有制備亞單位疫苗的潛力。

抗Iss抗血清；血清抗性；轉(zhuǎn)錄

大腸桿菌病是由某些埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli）的致病菌株引起的人畜共患的細(xì)菌性傳染病，病型復(fù)雜，危害最大的是急性敗血型。大腸桿菌的毒力是由多種毒力因子共同作用的，包括：黏附素、1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV質(zhì)粒、補(bǔ)體抗性、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、宿主細(xì)胞表面改變因子等[1-4]。進(jìn)入血流是細(xì)菌發(fā)揮其致病作用的關(guān)鍵一步，一旦病原菌進(jìn)入血液循環(huán)，它將面對(duì)血清的抑菌和殺菌作用。血清抗性可能受莢膜抗原、脂多糖和特定外膜蛋白調(diào)節(jié)。iss基因編碼的外膜蛋白（Iss）可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上對(duì)補(bǔ)體復(fù)合體敏感的位點(diǎn)，導(dǎo)致表面排斥，使菌體具有抗血清補(bǔ)體溶菌能力[5-7]。但細(xì)菌僅具有抵抗血清補(bǔ)體殺菌作用的能力，不足以支持其在血液中的大量增殖，菌體還必須能夠調(diào)整其新陳代謝以適應(yīng)血液的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。動(dòng)物機(jī)體的血液中，游離鐵的濃度是極低的，因此菌體需要具備獲得鐵的能力。ybtA基因和chuA基因被認(rèn)為與雞致病性大腸桿菌（Avian pathogenicEscherichia coli，APEC）的鐵攝取系統(tǒng)有關(guān)[8-12]。

抑制病原菌的血清抗性（補(bǔ)體抗性），降低其在血液中的存活和增殖，可減緩大腸桿菌病的進(jìn)程，尤其是減少敗血癥的發(fā)生。試驗(yàn)制備鼠源抗Iss抗血清，并探討抗Iss抗血清對(duì)大腸埃希菌血清抗性及在血清中增殖的抑制作用及機(jī)理，可為大腸桿菌病的亞單位疫苗的研制和應(yīng)用提供體外試驗(yàn)依據(jù)，有利于食品安全的防控。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 大腸桿菌O2為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室贈(zèng)送，經(jīng)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定的強(qiáng)毒株，血清型為O2，170 mL/L甘油于－70℃凍存保存；大腸桿菌CVCC1553購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，血清型O78，與O2菌株iss基因序列一致。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室早前雛雞致死試驗(yàn)和雞胚致死試驗(yàn)檢測(cè)，2株菌株的致死率表現(xiàn)一致，雛雞致死率為100%，雞胚致死率為70%，均為強(qiáng)致病性菌株。經(jīng)血清抗性試驗(yàn)檢測(cè)，2株菌株均為血清抗性菌株。

1.2 試劑 LB肉湯、麥康凱瓊脂購(gòu)自青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE蛋白電泳試劑盒購(gòu)自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；羊抗鼠IgG H&L (HRP) 購(gòu)自Abcam；RNA酶抑制劑及dNTP Mixture均購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自中科瑞泰（北京）生物工程有限公司；細(xì)胞細(xì)菌總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix、反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司。

1.3 鼠抗血清的制備 將0.1 mg純化的Iss融合蛋白與等量氫氧化鋁佐劑乳化后，選取4～6周齡小鼠進(jìn)行腹腔、頸后皮下以及腹股溝皮下注射，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)免疫。四免7 d后加強(qiáng)免疫，3 d后取血。于－20℃保存?zhèn)溆?，臨用前56℃ 30 min滅活補(bǔ)體[1,2,8]。

1.4 間接ELISA測(cè)抗血清效價(jià) 純化的融合蛋白用包被液稀釋至10 μg/mL，每孔100 μL。一抗進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)欢?:3000稀釋。采用常規(guī)間接ELISA方法進(jìn)行，OPD顯色[1,5]。

1.5 間接ELISA檢測(cè)菌體Iss蛋白的表達(dá) 新鮮培養(yǎng)的菌體分別以全菌體的方式或超聲裂解的方式，用包被液稀釋至108個(gè)/mL，每孔100 μL。一抗1:3000稀釋?zhuān)欢?:3000稀釋。采用常規(guī)間接ELISA方法進(jìn)行，OPD顯色[1,5]。

1.6 凝集試驗(yàn) 抗Iss抗血清用生理鹽水倍比稀釋為1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320，等量加入9.97×109個(gè)/mL的菌液，觀察凝集現(xiàn)象。

1.7 抗Iss抗血清對(duì)菌株血清抗性抑制作用的檢測(cè) 按照1:100接菌于LB中，按1:1000加入56℃ 30 min滅活抗血清及對(duì)照組陰性血清，37℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取1 mL菌液10 000×g離心，用0.6 mol/L NaCl溶液洗2次。0.9%生理鹽水重懸混勻，進(jìn)行倍比稀釋。在0.1 mL菌液中加入0.5 mL生理鹽水后，與0.4 mL新鮮血清混合，混合物于37℃溫育。分別于0、2 h取樣，涂板計(jì)數(shù)，37℃培養(yǎng)18 h，計(jì)活菌數(shù)[1,3]。按下式計(jì)算：

試驗(yàn)組血清抗性： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

對(duì)照組血清抗性： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

抑制作用：ΔΔlg=Δlg(試驗(yàn)組)-Δlg(對(duì)照組)

同時(shí)于0、2 h取樣，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR RNA提取及反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說(shuō)明書(shū)和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行；q P C R中，iss基因上游引物5'-GCCGCTCTGGCAA TGCTTATTACA-3'，下游引物5'-TCCTTTGGTG TTACTGCTGTCGGT-3'；ybtA基因上游引物5'-CCGATTCGAGAGCATTACCC-3'，下游引物5'-CAACAGCAGTGGGAGTCGAT-3'；chuA基因上游引物5'-CAGATAACAAAAGGAGCAAGGC-3'，下游引物5'-CTGACGATAATACTCACCGCC-3'；GAPDH基因上游引物5'-CATCGTTTCCAACG CTTCCT-3'，下游引物5'-ACCTTCGATGATGC CGAAGTT-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，56℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)。結(jié)果用Ct表示[13]。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA及凝集試驗(yàn) 經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，抗血清的效價(jià)為1:60 000。當(dāng)采用全菌體包被進(jìn)行ELISA檢測(cè)時(shí)，抗血清及陰性血清的待測(cè)樣孔ΔOD492<0.050、P/N<2.1，皆為陰性。在凝集試驗(yàn)中，各稀釋濃度均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。但在超聲裂解菌體后包被ELISA板的試驗(yàn)中，2株菌株均為Iss蛋白表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)表1。

結(jié)果顯示，融合蛋白免疫小鼠產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體，但全菌體包被的間接ELISA及凝集試驗(yàn)皆為陰性，超聲裂解菌體后包被的間接ELISA呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，表明抗血清與全菌體直接結(jié)合的作用較弱。間接ELISA檢測(cè)菌株Iss時(shí)，應(yīng)預(yù)先采用超聲等手段裂解細(xì)胞。

表1 間接ELISA、血清抗性抑制試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Indirect ELISA and inhibition results

2.2 抗Iss抗血清對(duì)菌株血清抗性抑制作用 抗血清組及對(duì)照陰性血清組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌體，與新鮮血清混合后，于0、2 h取樣計(jì)數(shù)。抗血清組及陰性血清組菌體與新鮮血清混合0 h的活菌數(shù)相近，而2 h后活菌數(shù)差異明顯，2株菌株的抗血清組活菌數(shù)明顯小于陰性血清組，結(jié)果用△△lg表示，見(jiàn)表1。本研究中平板計(jì)數(shù)的誤差通常≤0.200。采用95%置信區(qū)間分析，上限為0.176，下限為－0.158。2株菌株的△△lg均小于下限（－0.158），可認(rèn)為抗血清組及陰性血清組菌體在新鮮血清培養(yǎng)2 h后的活菌數(shù)有明顯差異，即抗血清組菌體的血清抗性受到抑制。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 抗血清組及對(duì)照陰性血清組培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌體，與新鮮血清混合后0、2 h分別取樣，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)iss、ybtA及chuA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，看家基因?yàn)镚APDH，結(jié)果用△Ct表示，見(jiàn)表2。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果Table 2 Quantitative real-time PCR result

由表2所示，混合后0 h時(shí)抗血清組的△Ct均大于陰性血清組（△△Ct>0），表明細(xì)菌與抗血清培養(yǎng)后，抗血清對(duì)iss、ybtA及chuA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均產(chǎn)生抑制。洗去抗血清并與含補(bǔ)體的新鮮血清溫育2 h后，抗血清組和陰性血清組的菌體iss及chuA基因的△Ct值均比0 h時(shí)下降，即mRNA轉(zhuǎn)錄水平在新鮮血清刺激下升高?？寡褰Miss及chuA基因的△△Ct均小于陰性血清組，結(jié)果顯示，在去除相應(yīng)抗血清后，試驗(yàn)組iss、ybtA及chuA基因呈現(xiàn)補(bǔ)償性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。

3 討論

血清對(duì)大腸桿菌具有抑菌作用和殺菌作用，可能受莢膜抗原、脂多糖和特定外膜蛋白等因素調(diào)節(jié)。抑制菌株的血清抗性或/和降低菌株在血液中的增殖，可減緩大腸桿菌病的進(jìn)程，尤其是減少敗血癥的發(fā)生。iss基因編碼的外膜蛋白被認(rèn)為是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面上對(duì)補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合體敏感位點(diǎn)，導(dǎo)致表面排斥，使菌體具有抗血清補(bǔ)體溶菌能力[5-7]。本試驗(yàn)中，在添加補(bǔ)體之前，抗血清和陰性血清組的活菌數(shù)無(wú)顯著差異，但添加補(bǔ)體后，2組菌株的活菌數(shù)出現(xiàn)明顯差異。結(jié)果顯示，抗血清并沒(méi)有直接殺死細(xì)菌，也不抑制其增殖。Iss蛋白是細(xì)菌外膜蛋白，推測(cè)抗血清是通過(guò)減少I(mǎi)ss蛋白在菌體表面的表達(dá)導(dǎo)致菌體血清抗性下降，進(jìn)而有利于補(bǔ)體發(fā)揮殺菌作用，因此在加入含補(bǔ)體的新鮮血清后，抗血清組的活菌數(shù)明顯下降。采用間接ELISA及凝集試驗(yàn)分析菌株Iss蛋白表達(dá)水平，超聲裂解菌體后的間接ELISA結(jié)果表明，O2、CVCC1553菌株均為Iss蛋白表達(dá)陽(yáng)性，但全菌體包被的間接ELISA和凝集反應(yīng)為陰性，表明抗血清與全菌體直接結(jié)合的反應(yīng)較弱。Iss是外膜蛋白，出現(xiàn)陰性結(jié)果可能是由于Iss暴露在菌體表面的結(jié)合位點(diǎn)較少，或與融合蛋白免疫產(chǎn)生的抗血清結(jié)合較弱，從另一方面也說(shuō)明，抗血清直接與Iss蛋白結(jié)合并導(dǎo)致菌體死亡或增殖抑制的可能性較低。由于Iss蛋白錨定在細(xì)胞膜上，而不是游離在細(xì)胞質(zhì)中，即使采用超聲裂解等手段，也不能確定所有Iss蛋白均完全暴露，因此不利于間接ELISA的定量分析，僅適于定性分析。

ybtA基因及chuA基因被認(rèn)為與雞致病性大腸桿菌的鐵采集系統(tǒng)有關(guān)，可調(diào)節(jié)菌體在血清中的鐵獲得能力，有利于菌體在血清中的增殖[8-12]。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，抗血清對(duì)iss、ybtA及chuA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均產(chǎn)生抑制。提示抗Iss抗血清可以通過(guò)抑制相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮其免疫保護(hù)作用。結(jié)合ELISA、凝集試驗(yàn)及血清抗性試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)菌體在增殖分裂過(guò)程中受到抗血清的影響，抑制了基因的轉(zhuǎn)錄，使菌體對(duì)血清環(huán)境敏感性提高。在洗去抗血清后，抗血清組的iss及chuA基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平在新鮮血清刺激下升高，而ybtA基因轉(zhuǎn)錄水平下降。iss、ybtA及chuA都是與細(xì)菌在血清中存活增殖有關(guān)的基因，在多項(xiàng)研究中表現(xiàn)出受血清刺激轉(zhuǎn)錄升高的現(xiàn)象[7-12]。但也有研究顯示1株O1血清型菌株在血清刺激下，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄未升高的現(xiàn)象[13]，這可能與試驗(yàn)條件及菌株差異有關(guān)。本試驗(yàn)中抗血清組iss、ybtA及chuA基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)幅度大于對(duì)照組，呈現(xiàn)補(bǔ)償性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，提示機(jī)體在整個(gè)感染期都需要抗血清持續(xù)的干預(yù)，若抗體水平不足可能導(dǎo)致免疫保護(hù)作用下降，這可能會(huì)限制Iss蛋白作為亞單位疫苗在免疫防制中的應(yīng)用。大腸桿菌病主要引起雛雞的大量死亡，對(duì)30日齡以上的雞致死率低。如試驗(yàn)中的菌株O2、CVCC1553雛雞致死率為100%，對(duì)30日齡以上的雞攻毒時(shí)在觀察期間僅產(chǎn)生明顯腹瀉，致死率僅為20%和0%（相關(guān)數(shù)據(jù)未發(fā)表）。因此，在雞的幼齡期提高免疫時(shí)效或階段性免疫可能是解決此問(wèn)題的途徑。另外，雖然本試驗(yàn)中Iss融合蛋白免疫產(chǎn)生的抗血清對(duì)血清型不同的2株菌（血清型分別為O2、O78）都產(chǎn)生了血清抗性抑制，體現(xiàn)出亞單位疫苗的優(yōu)勢(shì)，但大腸桿菌病受多毒力因子控制，Iss蛋白作為亞單位疫苗的潛力還需要更多試驗(yàn)證明。

抗Iss抗血清不能直接起到殺菌作用，但可在細(xì)菌增殖分裂期間通過(guò)抑制iss、ybtA及chuA等基因的轉(zhuǎn)錄，降低菌株的血清抗性和菌體在血清中的增殖能力，起到免疫保護(hù)作用。

[1]樊琛, 劉桂芹, 王亞君, 等. Iss蛋白在雞源大腸桿菌不同毒力菌株中的檢測(cè)[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2010, 42(2): 71-73.

[2]樊琛, 王亞君, 李一經(jīng).iss基因與雞大腸桿菌毒力相關(guān)性的分析[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2005, 36(1): 58-61.

[3]Johnson T J, Giddings C W, Horne S M,et al. Location of in-creased serum survivalgene and selected virulence traits on a conju-gative R plasmid in an avianEscherichia coliisolate[J]. Avian Dis, 2002, 46(2): 342-352.

[4]Nolan L K, Giddings C W, Home S M,et al. Complement resistance, as determined by viable count abd cytan entic methods and its association with the presence of iss and the virulence of avianEscherichia coli[J]. Avian Dis,2002,46(2): 386-392.

[5]樊琛, 劉桂芹, 王宇, 等. 雞源致病性大腸桿菌iss基因原核表達(dá)產(chǎn)物的免疫保護(hù)作用[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2010,42(11): 84-86.

[6]Mohamed M A, Shehata M A, Rafeek E. Virulence Genes Content and Antimicrobial Resistance inEscherichia colifrom Broiler Chickens[J]. Vet Med Int, 2014, 195189.

[7]Mellata M, Dho-Moulin M, Dozois C M,et al. Role of virulence factors in resistance of avian pathogenicEscherichia colito serum and in pathogenicity[J]. Infect Immun, 2003, 71(1): 536-540.

[8]Salehi T Z, Derakhshandeh A, Tadjbakhsh H,et al.Comparison and phylogenetic analysis of theissgene in two predominant avian pathogenicE. coliserogroups isolated from avian colibacillosis in Iran[J]. Res Vet Sci,2013, 94(1): 5-8.

[9]Skyberg J A, Johnson T J, Nolan L K. Mutational and transcriptional analyses of an avian pathogenicEscherichia coliColV plasmid[J]. BMC Microbiol, 2008,8(1): 24.

[10]Oh J Y, Kang M S, Yoon H,et al. The embryo lethality ofEscherichia coliisolates and its relationship to the presence of virulence-associated genes[J]. Poult Sci,2012, 91(2): 370-375.

[11]Radwan I A, Salam H S H, Abd-Alwanis S A A,et al.Frequency of some virulence associated genes among multidrug-resistantEscherichia coliisolated from septicemic broiler chicken[J]. Int J Adv Res, 2014, 2(12):867-874.

[12]Salari S, Salehi T Z, Fasaei B N,et al. Construction of an iss deleted mutant strain from a native avian pathogenicEscherichia coliO78: K80 andin vitroserum resistance evaluation of mutant[J]. Iranian J Vet Med, 2014, 8: 1-8.

[13]Li G, Tivendale K A, Liu P,et al. Transcriptome Analysis of Avian PathogenicEscherichia coliO1 in Chicken Serum Reveals Adaptive Responses to Systemic Infection[J]. Infect Immun, 2011, 79(5): 1951-1960.

MECHANISM OF ANTI-ISS SERUM AGAINST AVIAN PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI

FAN Chen, ZENG Qing-hua, WANG Hui, LI Yan, LIU Gui-qin, SUN Xiao-fan, ZHENG Huan-qin

(Agricultural College of Liaocheng University, Liaocheng 252059, China)

The iss gene is the virulence gene of avian E. coli, which is related to its serum resistance. However, there are few reports regarding immune protection of the Iss protein. In the present study, the GST-Iss fusion protein was used to immunize 4-6 week-old mice.The indirect ELISA was used to detect the titer of the antiserum and the expression of Iss protein in pathogenic E. coli strains CVCC1553 and O2. The changes of serum resistance and mRNA transcription level were detected in these two strains as detected using in vitro serum resistance inhibition and real-time fl uorescence quantitative PCR assay for iss, ybtA, chuA genes. The results concluded that the anti-Iss serum inhibited the serum resistance of O2 and CVCC1553 strains in vitro and reduced the transcription of iss, ybtA and chuA genes in different serotype strains. The mechanism for the anti-Iss serum may be due to its role in decreasing the serum resistance of pathogenic bacteria by reducing the transcription of the serum resistance related genes. In addition, Iss protein may have the potential for development of the subunit vaccine.

Anti-Iss serum; serum resistance; transcription

S852.612

A

1674-6422（2018）01-0043-05

2017-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（31302128）；聊城大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（31805）

樊琛，女，博士，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)、食品安全方向的研究

樊琛，E-mail：fanchen7810@126.com